植物基因工程载体和其构建课件.ppt

第一节载体概述具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；
具备合适的酶切位点，供外源片段插入；
含有供选择转化子的标记基因；
适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；
载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；
载体大小：原则上要求载体越小越好；
如果需要外源基因的表达：启动子。2.载体的种类按功能分：第二节质粒载体质粒空间构型3、质粒的自主复制性4、质粒的不相容性5、质粒的可转移性6、携带特殊的遗传标记筛选标记基因互补筛选法lacZΔM15放在F质粒上，随宿主传代；
lacZ’放在载体上，作为筛选标记；
受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。7、天然质粒载体的局限性天然质粒8、常用的质粒载体衍生质粒：pBR325、pBR327及pAT153等。（2）pUC质粒载体pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19（3）pGEM系列载体（3）pBluescriptIIKS(±)系列载体9、PCR产物克隆载体商业化T载体
一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。
自制T载体
一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：

TOPO技术因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。TOPO-Blunt载体TOPO克隆高效性原理

Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。
10、质粒提取具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；
具备合适的酶切位点，供外源片段插入；
含有供选择转化子的标记基因；
适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；
载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；
载体大小：原则上要求载体越小越好；
如果需要外源基因的表达：启动子。11、大肠杆菌感受态制备及转化（2）电击法12、大肠杆菌重组子筛选和检测思考题第三节工程载体一、根瘤农杆菌Ti质粒载体Agrobacteriumtumefaciens2.Ti质粒的功能区域T-DNA区(transferredDNAregions)Vir区的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，能够使农杆菌表现出毒性；
Vir区总长约35kb，包括7个基因，VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH；
VirA：组成性表达；VirB、VirC、VirD、VirE：诱导性表达：VirG：受信号分子诱导后表达量提高10多倍；
信号分子：乙酰丁香酮等。毒性区对T-DNA的作用既可以顺式作用进行，也可以反式作用进行。两种情况下T-DNA都可在毒性区作用下转移并整合到植物基因组中；
顺式作用：指T-DNA区与毒性区位于同一个Ti质粒上；
反式作用：指T-DNA与毒性区不在同一Ti质粒上，而位于另一个相应的中间载体质粒上。调控Ti质粒的自我复制。4、Ti质粒基因转化机理VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。
VirD1具有拓扑异构酶活性，将超螺旋DNA变为松弛DNA；
VirD2具有核酸内切酶活性，切割双链DNA的一条链。C端有核定位信号。（2）T链复合物的形成（3）T链复合物的转运（4）T链复合体靶向植物细胞核（5）T链整合到基因组T-DNA插入的遗传特性：
T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。
另一个常见的结果是，在T-DNA／植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，这些“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。
在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（5～10b）同源，则可以在整合中起作用。4、Ti质粒的生物学功能4、Ti质粒的改造一元载体和双元载体酶切连接系统同源重组系统infusion重组系统5、表达载体转化根癌农杆菌转化农杆菌后如何进行酶切鉴定？二、发根农杆菌Ri质粒载体从发展植物基因工程载体考虑，Ri质粒是颇有吸引力的。这是因为在不同的双子叶植物中，由Ri质粒诱发产生的合成冠瘿碱不定根组织，经过培养基中的植物激素的刺激作用，都可再生成可育的完整的植株。解释Ti质粒载体的许多概念对于Ri质粒载体也是适用的。现在已发展出了Ri质粒载体的共合体系三、植物病毒载体1、单链的RNA植物病毒2、单链植物DNA病毒载体3、双链DNA植物病毒载体第四节标记基因1标记基因和报告基因的构建