植物基因工程载体及其构建全套ppt.ppt

第三章植物基因工程载体及其构建第一节载体概述具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备适宜的酶切位点，供外源片段插入；含有供选择转化子的标记基因；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；载体的平安性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体大小：原那么上要求载体越小越好；如果需要外源基因的表达：启动子。2.载体的种类按功能分：第二节质粒载体质粒空间构型3、质粒的自主复制性4、质粒的不相容性5、质粒的可转移性6、携带特殊的遗传标记筛选标记基因互补筛选法lacZΔM15放在F质粒上，随宿主传代；lacZ’放在载体上，作为筛选标记；受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。7、天然质粒载体的局限性8、常用的质粒载体衍生质粒：pBR325、pBR327及pAT153等。〔2〕pUC质粒载体pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19〔3〕pGEM系列载体〔3〕pBluescriptIIKS(±)系列载体9、PCR产物克隆载体商业化T载体一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶〔如EcoRV〕将克隆载体进行线性化，然后再单独参加dTTP和Taq酶72～75℃反响，进行末端的加T。自制T载体一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：TOPO技术因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。TOPO-Blunt载体TOPO克隆高效性原理Topo连接反响有两个分子参与，而传统的连接反响有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。10、质粒提取具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备适宜的酶切位点，供外源片段插入；含有供选择转化子的标记基因；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；载体的平安性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体大小：原那么上要求载体越小越好；如果需要外源基因的表达：启动子。11、大肠杆菌感受态制备及转化〔2〕电击法12、大肠杆菌重组子筛选和检测思考题第三节工程载体一、根瘤农杆菌Ti质粒载体Agrobacteriumtumefaciens2.Ti质粒的功能区域T-DNA区(transferredDNAregions)Vir区的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，能够使农杆菌表现出毒性；Vir区总长约35kb，包括7个基因，VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH；VirA：组成性表达；VirB、VirC、VirD、VirE：诱导性表达：VirG：受信号分子诱导后表达量提高10多倍；信号分子：乙酰丁香酮等。毒性区对T-DNA的作用既可以顺式作用进行，也可以反式作用进行。两种情况下T-DNA都可在毒性区作用下转移并整合到植物基因组中；顺式作用：指T-DNA区与毒性区位于同一个Ti质粒上；反式作用：指T-DNA与毒性区不在同一Ti质粒上，而位于另一个相应的中间载体质粒上。调控Ti质粒的自我复制。4、Ti质粒基因转化机理VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。VirD1具有拓扑异构酶活性，将超螺旋DNA变为松弛DNA；VirD2具有核酸内切酶活性，切割双链DNA的一条链。C端有核定位信号。〔2〕T链复合物的形成〔3〕T链复合物的转运〔4〕T链复合体靶向植物细胞核〔5〕T链整合到基因组T-DNA插入的遗传特性：T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。另一个常见的结果是，在T-DNA／植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充〞DNA〔FillerDNA〕存在，这些“填充〞DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。在植物靶位处不要求有特异的序列，但假设在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列〔5～10b〕同源，那么可以在整合中起作用。4、Ti质粒的生物学功能4、Ti质粒的改造一元载体和双元载体酶切连接系统同源重组系统infusion重组系统5、表达载体转化根癌农杆菌转化农杆菌后如何进行酶切鉴定？Ori区〔originofreplication〕3转基因植物常用的报告基因T-DNA区Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，诱发肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。这样，其同时作为限制酶和连接酶。表达产物能进行定量测定。是构建中间表达载体的根底质粒。该DNA片段上的onc基因与肿瘤的形成有关。1标记基因和报告基因的构建通达与Ｔ链非共价结合，VirE2可包被T链,形成细长的核-蛋白丝,因而故VirE2不仅保护ssD