基因工程载体构建蛋白表达.ppt

（优选）基因工程载体构建蛋白表达真核细胞与原核细胞的比较原核细胞与真核细胞的区别原核表达与真核表达的区别乳糖操纵子学说(原核基因的表达调控)真核细胞的复制、转录、翻译mRNA剪切第一节外源目的基因在原核细胞中的表达一、原核基因表达载体的构成
DNA复制及重组载体的选择系统
复制子:扩增
选择标记：筛选
外源基因的转录系统
启动子
抑制物基因
转录终止子
蛋白质的翻译系统
核糖体结合位点
翻译起始密码子
翻译终止密码子
pBR322old-stylegeneralpurposeplasmid
DNA复制及重组载体的选择系统
复制子：包含复制起始位点（ori)和有关序列在内的DNA片段。
常见复制子有pMB1,p15A,ColE1和pSC101等。
前3者为松弛复制型，含pSC101复制子的质粒载体严谨复制型。
选择标记：抗生素抗性基因

外源基因的转录系统
启动子:能被宿主RNA聚合酶特异识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用的位置特性和种属特异性。
诱导型启动子：Lac、Trp、Tac等
组成型启动子：T7噬菌体启动子
抑制物基因:其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使拟制物失活，启动子功能恢复。
转录终止子：终止RNA聚合酶转录的DNA序列。
本正终止子：不需要其他蛋白辅助因子，
依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如ρ因子）
防止转录过头
3）蛋白质的翻译系统
影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5’端非翻译序列和蛋白编码区的5’端序列
核糖体结合位点
翻译起始密码子
翻译终止密码子

核糖体结合位点：原核生物转录起始位点(RBS)下游的一段DNA序列，由SD序列和起始密码子组成。SD序列大约3-9bp,位于ATG上游3-11bp处。SD序列可与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合。大肠杆菌SD序列为5’AGGAGG3’，其中GGAG4碱基发生任何改变均大幅度降低翻译效率。

翻译起始密码子：一般为ATG(AUG),编码甲硫氨酸(Met),也有采用其他密码子。
影响翻译效率的因素有：SD序列、翻译起始密码子、SD序列和翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。据报道，SD序列后面为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高，而当为CCCC或GGGG时效率最低。

翻译终止密码子：它核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落，终止翻译过程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因子RF1和RF2调控。RF1识别UAA和UAG,RF2识别UAA和UGA，故选UAA作终止密码子。可将几个终止密码子串联。据悉UAAU为有效终止密码子。

二、常见的原核细胞表达载体系统三、外源基因在原核细胞中的表达形式（一）包涵体（二）融合蛋白融合蛋白的特点融合蛋白的特点（三）寡聚型的外源蛋白…多个外源蛋白基因串联多表达单元的重组：
每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码。
---表达分子量较大的蛋白，
不需要裂解处理。启动子相互竞争
多顺反子重组：
多拷贝的外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止密码，但转录在共同的转录启动子和终止子下进行。---表达中等外源蛋白。多编码序列重组：
多个基因串联，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。(四)整合型外源蛋白（五）分泌型外源蛋白分泌型表达的优点四、在原核细胞中高效表达目的基因（一）高效表达外源基因的基本策略
载体构建的优化
选用强启动子、强终止子
使SD序列与核糖体16SrRNA的碱基完全配对
调整SD序列与起始密码ATG之间的距离
防止核糖体结合位点附近序列转录后的mRNA形成二级结构
提高稀有密码子的表达频率
通过点突变方法改造外源基因的稀有密码
构建基因高表达受体菌
大肠杆菌缺乏翻译后加工和蛋白质折叠系统
提高外源基因表达产物的稳定性
提高外源基因表达产物的稳定性（二）目的基因表达水平的提高与检测目的基因表达产物的检测第二节外源目的基因在真核细胞中的表达真核表达载体的功能元件增强子元件二、酵母表达系统酵母基因表达载体的组成元件启动子分泌信号序列酵母基因表达载体的类型表达外源基因的酵母宿主菌YeastExpressionSystem以AOX1为启动子，以AOX1基因缺失突变体为受体细胞，可高效表达外源基因。
或用组氨酸脱氢酶突变体作为受体细胞，从而对携带his标记基因的转化子进行筛选。
还有蛋白酶缺陷宿主菌巴斯德毕赤酵母表达系统的优点ExpressionVectors宿主菌与转化方法培养基