植物基因工程载体及其构建ppt课件.ppt

第八章植物基因工程载体及其构建植物基因转化系统第一节植物基因工程载体种类第二节根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能2.Ti质粒的功能区域2.T-DNA的结构特点3.T-DNA上的编码基因及功能T-DNA区基因的功能T-DNA区编码的基因T-DNA区编码基因的功能三、Vir区操纵子的基因结构与功能1.Vir区操纵子的基因结构2.VirA操纵子的诱导表达及功能3.VirG操纵子的诱导表达及功能4.VirH、F及Tzs操纵子的诱导表达及其功能第三节农杆菌Ti质粒基因转化机理一、T-DNA的加工及转移1.T-DNA的复制2.VirD1及VirD2的功能3.VirC的功能二、T链蛋白复合体的形成及VirE的功能三、T链复合体的转运及VirB的功能1.跨膜或膜结合蛋白有两个主要特性2.VirB的功能四、T链复合体靶向植物细胞核五、T链整合植物基因组的分子机理1.整合位点及其特性2.T-DNA的整合机理3.T-DNA整合的遗传效应六、农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控第四节农杆菌Ti质粒的改造及载体构建一、Ti质粒的改造及卸甲载体构建为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为”中间载体”（intermediatevector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲载体（disarmedvector）。
1．Onc-卸甲载体2.Onc十卸甲载体二、中间载体的构建1.中间载体的基本结构与特点共整合系统中间载体的特征双元载体系统的中间载体三、中间表达载体的构建1．启动子及其它调控序列1．启动子及其它调控序列2.嵌合基因（chimericgene）构建3中间表达载体的构建过程四、植物基因转化载体系统的构建1．一元载体系统的构建（1）共整合载体的构建（2）SEV的构建（3）SEV与pGV3850比较2．双元载体系统（1）双元载体系统的构建原理（2）微型Ti质粒（mini-Tiplasmid）（3）辅助Ti质粒（4）双元载体的构建（5）一元载体系统和双元载体系统的比较（5）一元载体系统和双元载体系统的比较3．载体卡盒五、载体构建中常用的选择标记及报告基因1．选择标记的应用2．报告基因的应用目前作为筛选标记的基因2）Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）
Gus基因来自大肠杆菌染色体上的uidA位点。它在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点：①在一定条件下与X-G1ucuionicacid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。②当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。③检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。④比Cat和NptII检测便宜2000倍，而且还不需要使用放射性同位素。3）Cat（氯霉素乙酰移酶基因）
Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自细菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的结构基因。Nos-Cat嵌合基因一旦在植物细胞中得到表达，即可敏感地检测这种酶的存在。它可以利用荧光光谱法测定，但由于植物内源活性本底较高限制了它的灵敏度。Cat酶的活力是通过薄层层析法和放射自显影法测定，操作比较繁琐。一般情况下，Cat表达产物没有Gus基因稳定，而且在测定时花费较大，所以现在使用中逐渐减少，被Gus基因代替。4）GFP（绿色荧光蛋白基因）3．选择标记和报告基因的选择策略