同时检测四种病毒的引物、引物对、方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN103088150103088150B(45)授权公告日2014.08.13(21)申请号201110448164.7TW200848735A,2008.12.16,(22)申请日2011.12.22alvinjin-cherngeun,etal..Simultaneousquantitationoftwoorchidvirusesbythe(30)优先权数据TaqMan&reg1001394542011.10.28TWreal-timeRT-PCR.《journalof(73)专利权人台湾糖业股份有限公司virologicalmethods》.2000,第87卷地址中国台湾台南市东区生产路68号周国辉等.双重一步法RT-PCR同时检测兰花(72)发明人黄怡仁陈郁璇上的两种主要病毒.《农业生物技术学报》.2004,第12卷(第6期),第743-744页.(74)专利代理机构北京汇智英财专利代理事务所(普通合伙)11301审查员方晓云代理人郑玉洁(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C40B40/06(2006.01)C12R1/94(2006.01)(56)对比文件TW200942617A,2009.10.16,KR10-2011-0049513A,2011.05.12,CN101871019A,2010.10.27,CN101781656A,2010.07.21,权利要求书2页权利要求书2页说明书10页说明书10页TW201035320A,2010.10.01,序列表4页序列表4页附图7页附图7页(54)发明名称同时检测四种病毒的引物、引物对、方法及试剂盒(57)摘要本发明关于可同时检测选自蕙兰嵌纹病毒(Cymbidiummosaicvirus；CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontglossumringspotvirus；ORSV)、胡瓜嵌纹病毒(Cucumbermosaicvirus；CMV)及番椒黄化病毒(Capsicumchlorosistospovirus；CaCV)的病毒的引物、引物对、方法及试剂盒。CN103088150BCN10385BCN103088150B权利要求书1/2页1.一种同时检测植物样本中4种病毒感染的方法，其中这些病毒为蕙兰嵌纹病毒(Cymbidiummosaicvirus；CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontglossumringspotvirus；ORSV)、胡瓜嵌纹病毒(Cucumbermosaicvirus；CMV)及番椒黄化病毒(Capsicumchlorosistospovirus；CaCV)，该方法包含下列步骤：(a)提供植物样本；(b)提供对于CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸具有专一性的引物对；(c)利用这些引物对在可同时扩增这些病毒核酸的条件下对该植物样本进行反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)，以扩增CyMV、ORSV、CMV及CaCV的特异性核酸；及(d)检测经扩增的样本中是否含有这些病毒的核酸；其中，该对于CyMV具有专一性的引物对包括由SEQIDNO:7的序列组成的寡核苷酸及由SEQIDNO:8的序列组成的寡核苷酸；该对于ORSV具有专一性的引物对包括由SEQIDNO:5的序列组成的寡核苷酸及由SEQIDNO:6的序列组成的寡核苷酸；该对于CMV具有专一性的引物对包括由SEQIDNO:1的序列组成的寡核苷酸及由SEQIDNO:2的序列组成的寡核苷酸；该对于CaCV具有专一性的引物对包括由SEQIDNO:3的序列组成的寡核苷酸及由SEQIDNO:4的序列组成的寡核苷酸；该可同时扩增这些病毒核酸的条件包含：该反应的反应液中，镁离子的浓度介于4mM至7mM之间；及这些引物的总和浓度介于200nM至800nM之间。2.如权利要求1的方法，其中该CyMV的核酸来自CyMV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该ORSV的核酸来自ORSV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该CMV的核酸来自CMV的鞘蛋白基因，及该CaCV的核酸来自CaCV的核鞘蛋白基因。3.如权利要求1的方法，其进一步包括使用内标引物对，该内标引物对可扩增蝴蝶兰肌动蛋白基因的片段，该引物对选自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11及SEQIDNO:12的核酸序列所组成的群。4.如权利要求1的方法，其中该反转录聚合酶链锁反应为实时反转录聚合酶链锁反应(real-timeRT-PCR)或多重反转录聚合酶链锁反应(multiplexRT-PCR)。5.如权利要求4的方法，其中该反转录聚合酶链锁反应为实时反转录