一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104651538A(43)申请公布日2015.05.27(21)申请号201510106726.8(22)申请日2015.03.11(71)申请人珠海国际旅行卫生保健中心地址519000广东省珠海市拱北侨光路133号(72)发明人汪海波谭华冯子力伍碧梅李艳兰赵俊华王琪莫秋华杨泽林继灿(74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司44100代理人华辉张奇洲(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表5页附图3页(54)发明名称一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒(57)摘要本发明公开了一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组及含有上述引物的四联检测试剂盒，所述试剂盒可以特异性检测四种腹泻病毒：轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒。本发明通过对四种病毒基因组分别的同源性比对分析，寻找各自高度同源的保守序列设计引物，并利用高分辨率熔解曲线分析技术，同时检测四种腹泻病毒，具有简便快速、廉价、安全、灵敏度高、特异性强的特点，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。CN104651538ACN104651538A权利要求书1/1页1.一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组，包括，用于检测轮状病毒的引物：正向F1：5’-GATACNTTRCCTGAYGGAGA-3’(SEQIDNO.1)，反向R1：5’-CATCYTGAAAKATDGCATCACA-3’(SEQIDNO.2)；用于检测星状病毒的引物：正向F2：5’-AAAAYGTDCGAHTGAAGGA-3’(SEQIDNO.3)，反向R2：5’-ABACAGTTCTYAACCAATG-3’(SEQIDNO.4)；用于检测诺如病毒的引物：正向F3：5’-AGRGTBGTCGTHTGGGACGA-3’(SEQIDNO.5)，反向R3：5’-TGNGGGGTGTTNCCRTTCTT-3’(SEQIDNO.6)；用于检测札如病毒的引物：正向F4：5’-ACTGTNMAYGGKTTCCATGT-3’(SEQIDNO.7)，反向R4：5’-CAGGRGANCGGTGTGTRCCAAT-3’(SEQIDNO.8)；所述引物的病毒核酸变异位点使用简并碱基，R为A/G，K为G/T，M为A/C，W为A/T，Y为C/T，S为C/G，V为A/C/G，B为C/G/T，H为A/T/C，D为A/G/T，N为A/G/T/C。2.一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的四联检测试剂盒，含有权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括2X扩增反应液、5X酶混合液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。4.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述2X扩增反应液包括：Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT、亚精胺、Tween-20、牛血清白蛋白、dNTP、荧光染料和权利要求1所述引物组。5.根据权利要求4所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为EvaGreen。6.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述5X酶混合液包括反转录酶、RNases抑制剂和HS-Taq酶。7.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品分别为轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒体外转录的RNA片段。8.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为无菌生理盐水。9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述空白对照为DEPC处理的无核酸酶的超纯水。2CN104651538A说明书1/7页一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolutionMeltingAnalysis,HRMA)的腹泻病毒快速检测试剂盒，及所述试剂盒中使用的对于四种腹泻病毒(轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒)具有特异性的四对引物。背景技术[0002]腹泻病(diarrheadiseases)是严重影响人类健康的一个重要公共卫生问题，在发展中国家如亚、非、拉地区尤为严重。世界卫生组织(WHO)统计数据显示，全球5岁以下婴幼儿，每年有10亿患腹泻，其中500万死亡。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。病毒性腹泻在腹泻中占有重要的比例，轮状病毒(Rotavirus，RV)、星状病毒(Astrovirus，AV)、诺如病毒(No