检测猪Kobu病毒的RT-PCR引物及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103571973103571973A(43)申请公布日2014.02.12(21)申请号201310462276.7(22)申请日2013.09.30(71)申请人广西壮族自治区动物疫病预防控制中心地址530001广西壮族自治区南宁市西乡塘区友爱北路51号申请人桂林市动物疫病预防控制中心(72)发明人熊毅伍和明韦达有梁丹洁冯淑萍颜健华(74)专利代理机构广西南宁汇博专利代理有限公司45114代理人朱萍球(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书5页说明书5页序列表1页序列表1页附图1页附图1页(54)发明名称检测猪Kobu病毒的RT-PCR引物及试剂盒(57)摘要本发明公开了一对检测猪Kobu病毒的RT-PCR引物及试剂盒，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-AACTCCAGCTTTCCCTCCT-3′，下游引物核苷酸序列为5′-TGGCCACCTGCAAAGTCA-3′，所述试剂盒包括所述的引物。采用本发明引物检测猪Kobu病毒，具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点。CN103571973ACN103579ACN103571973A权利要求书1/1页1.一对检测猪Kobu病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-AACTCCAGCTTTCCCTCCT-3′，下游引物核苷酸序列为5′-TGGCCACCTGCAAAGTCA-3′。2.一种检测猪Kobu病毒的试剂盒,其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述检测猪Kobu病毒的试剂盒,其特征在于，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。4.根据权利要求3所述检测猪Kobu病毒的试剂盒,其特征在于：（1）所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；（2）所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物K2；（3）所述PCR反应试剂包括：TaqDNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl2和cDNA；（4）所述阴性对照包括：DEPC水；（5）所述阳性对照包括：猪Kobu病毒。5.根据权利要求4所述检测猪Kobu病毒的试剂盒,其特征在于，所述猪Kobu病毒为：克隆有VP1基因的猪KoBu病毒阳性质粒。6.一种如权利要求4或5所述检测猪Kobu病毒试剂盒的使用方法，包括以下步骤：（1）病毒RNA的提取：取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；加入25μLDEPC水，-20℃保存备用；（2）RT操作程序：取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs2μL、M-MLV0.5μL、HIR0.5μL、下游引物K22μL，RNA15μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42℃60min，95℃5min；（3）PCR操作程序：上游引物K10.5μL、下游引物K20.5μL，TaqDNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs2μL、MgCl22μL、DEPC水12.3μL,cDNA5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环。2CN103571973A说明书1/5页检测猪Kobu病毒的RT-PCR引物及试剂盒技术领域[0001]本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一对检测猪Kobu病毒的RT-PCR引物及试剂盒。背景技术[0002]KoBu病毒(KoBuvirus)属于小核糖核酸病毒科成员，与口蹄疫为同科病毒，为无囊膜单链RNA病毒，基因组大小为8.2kb～8.3kb，包含编码一个聚合蛋白的大的开放阅读框（ORF）。聚合蛋白由3个结构蛋白（VP0、VP3、VP1）和7个非结构蛋白（2A～2C、3A～3D）组成。目前已经证实KoBu病毒至少分为3个种，