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本发明公开了一种检测烟草病毒的引物组、试剂盒及方法。所述引物组由引物对A、引物对B、引物对C、引物对D四对中的一对或多对组成;所述引物组A由序列表的序列1至序列2所示的单链DNA分子组成的引物对;所述引物组B由序列表的序列3至4所示的单链DNA分子组成的引物对;所述引物组C由序列表的序列5至6所示的单链DNA分子组成的引物对;所述引物组D由序列表的序列7至8所示的单链DNA分子组成的引物对;本发明省略了单一病毒引物逆转录合成cDNA第一链和病毒核苷酸序列测定与分析等步骤,利用多重PCR的快速和灵敏性获得目的片段,为大量、快速、准确、灵敏检测烟草等植株样品建立了一种科学的方法。