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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107338267A(43)申请公布日2017.11.10(21)申请号201610284371.6C12N15/66(2006.01)(22)申请日2016.05.03(71)申请人中国科学院深圳先进技术研究院地址518055广东省深圳市南山区西丽大学城学苑大道1068号申请人深圳先进技术研究院深圳市疾病预防控制中心深圳市南山区人民医院(72)发明人万晓春李俊鑫刘绿艳任晓虎周启明(74)专利代理机构北京三友知识产权代理有限公司11127代理人韩蕾姚亮(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表3页附图1页(54)发明名称双顺反子表达载体及其构建方法与应用(57)摘要本发明提供了一种双顺反子表达载体及其构建方法与应用,具体是一种用来高效、稳定转染二氢叶酸还原酶营养缺陷型突变CHO细胞株(CHO/dhfr-)的双顺反子表达载体,其是在pIRES质粒上分别插入S100a6启动子、目的基因和dhfr基因构建而成。本发明通过使用低温诱导型启动子和构建双顺反子载体,弱化dhfr基因的表达,使目的基因仅仅通过两或三轮的加压筛选,在低浓度MTX下获得足够的拷贝数,同时利用诱导启动子的性质,在生产过程中降低温度,最大限度增加重组蛋白的产量。CN107338267ACN107338267A权利要求书1/1页1.一种双顺反子表达载体,其是在pIRES质粒上分别插入S100a6启动子、目的基因和dhfr基因构建而成。2.一种双顺反子表达载体的构建方法,该方法包括:在pIRES质粒相邻的酶切位点XmaI和NotI之间插入共扩增基因dhfr,使dhfr基因置于核糖体进入位点(IRES)的下游;在pIRES质粒的IRES上游的多克隆位点中插入目的基因;用限制酶BglII和NheI双酶切pIRES质粒,切除Pcmv启动子,S100a6启动子(Ps)经同样双酶切后插入pIRES质粒中形成重组的双顺反子表达载体pIRES-Ps-dhfr。3.根据权利要求2所述的方法,该方法包括:以dhfr全长转录本cDNA克隆为模板,用含有XmaI酶切位点的上游引物和含有NotI酶切位点的下游引物,PCR扩增dhfr基因,扩增产物回收纯化后经XmaI和NotI双酶切,插入经同样双酶切的pIRES中,得到含有共扩增基因的重组质粒pIRES-dhfr;将重组质粒转化到大肠杆菌中保存;提取CHO细胞株的DNA,并以此为模板用含BglII酶切位点的上游引物和含有NheI酶切位点的下游引物,PCR扩增S100a6的启动子,扩增产物回收纯化后用NheI和BglII双酶切,与同样双酶切切除了Pcmv启动子的pIRES-dhfr载体相连,得到pIRES-Ps-dhfr;在多克隆位点MCSA(NheI、XhoI、EcoR1、Mlu1)插入目的基因。4.根据权利要求3所述的方法,其中,PCR扩增S100a6启动子所需要的含有BglII酶切位点的上游引物为F2:GTCAGATCTATGCCGGAGTCACGAGTCAC,含有NheI酶切位点的下游引物为S2:GCCTTTGGAGGATGATAAGCTTAATTGACCACTGG。5.根据权利要求3所述的方法,其中,PCR扩增dhfr基因所需要的含有XmaI酶切位点的上游引物为F1:CTACCCGGGCCACCATGCTTGGACCGCTGAA,含有NotI酶切位点的下游引物为S1:CGATGCGGCCGCTTAGCCTTTCTTCTCATAGACT。6.PCR扩增S100a6启动子所需要的含有BglII酶切位点的上游引物F2:GTCAGATCTATGCCGGAGTCACGAGTCAC和含有NheI酶切位点的下游引物S2:GCCTTTGGAGGATGATAAGCTTAATTGACCACTGG。7.PCR扩增dhfr基因所需要的含有XmaI酶切位点的上游引物F1:CTACCCGGGCCACCATGCTTGGACCGCTGAA和含有NotI酶切位点的下游引物S1:CGATGCGGCCGCTTAGCCTTTCTTCTCATAGACT。8.权利要求1所述的双顺反子表达载体在CHO细胞中表达目的蛋白中的应用。9.根据权利要求8所述的应用,其中,是利用低温诱导启动子弱化dhfr表达。10.根据权利要求8所述的应用,其中,在CHO细胞中表达目的蛋白的过程包括:接种DHFR缺陷型的CHO细胞,加入含血清、不含抗生素的DMEM培养基,37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合;转染表达载体;继续培养;进行单克隆筛选和基因扩增;降温培养细胞高效生产重组蛋白。2CN107338267A说明书1/5页双顺反子表达载体及其构建方法与应用技术