一种双载体表达体系及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114214354A(43)申请公布日2022.03.22(21)申请号202111677260.9C12N9/24(2006.01)(22)申请日2021.12.31C12N9/38(2006.01)C12N9/44(2006.01)(71)申请人天津科技大学C12N1/21(2006.01)地址300457天津市滨海新区经济技术开C12R1/07(2006.01)发区第十三大街29号C12R1/10(2006.01)(72)发明人牛丹丹王正祥申培立C12R1/125(2006.01)(74)专利代理机构北京瑞盛铭杰知识产权代理C12R1/11(2006.01)事务所(普通合伙)11617代理人栗华楠(51)Int.Cl.C12N15/75(2006.01)C12N15/68(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N9/26(2006.01)C12N9/10(2006.01)权利要求书1页说明书12页序列表15页附图3页(54)发明名称一种双载体表达体系及其构建方法与应用(57)摘要本发明属于基因工程和发酵工程领域，具体涉及一种快捷构建酶制剂高产菌株的方法及其专用载体。本发明构建了辅助载体pUB‑toxic和整合表达载体pUB‑Exp。克隆目的基因入pUB‑Exp后获得重组表达质粒pUB‑Enz，然后将辅助载体pUB‑toxic和重组表达质粒pUB‑Enz先后转入宿主细胞中，再通过提高培养温度、诱导剂和高浓度适宜抗生素，诱使辅助载体pUB‑toxic丢失和pUB‑Enz整合入宿主细胞基因组中并进行基因扩增，再经过平板等筛选获得目标酶制剂的高产菌株。利用本发明提供的方法，可方便快捷地获得遗传稳定性好、产酶水平高的产酶高产菌，可应用于相应酶制剂的高效制备和规模化低成本生产。CN114214354ACN114214354A权利要求书1/1页1.一种双载体表达体系，其特征在于，包括两个温敏载体：pUB‑toxic和pUB‑Enz；所述pUB‑toxic，具有温敏复制原点、携带有毒蛋白编码基因，且毒蛋白的表达受诱导启动子严谨型控制；所述pUB‑Exp，携带目标基因表达盒元件，一段与宿主细胞同源的DNA序列，且载体骨架中的复制酶基因repF被破坏。2.如权利要求1所述的一种双载体表达体系，其特征在于，所述pUB‑toxic和pUB‑Enz以温敏复制型大肠杆菌‑芽胞杆菌穿梭质粒为骨架质粒。3.如权利要求2所述的一种双载体表达体系，其特征在于，pUB‑toxic的骨架质粒为pT2ts，pNZT1,pKGFP194ts或pKVM1质粒；pUB‑Exp的骨架质粒为pT2ts，pNZT1,pKGFP194ts或pKVM1质粒。4.如权利要求1所述的一种双载体表达体系，其特征在于，所述毒蛋白编码基因为mazF、ccdB、relE或endoA。5.如权利要求1所述的一种双载体表达体系，其特征在于，所述诱导启动子为乳糖诱导型启动子、蔗糖诱导型启动子或木糖诱导型启动子。6.如权利要求1所述的一种双载体表达体系，其特征在于，所述pUB‑toxic、pUB‑Exp携带有不同的抗性标记。7.如权利要求1所述的一种双载体表达体系，其特征在于，所述pUB‑Exp携带的表达盒元件来自质粒pHY‑WZX，pHT1469或pWH1520。8.如权利要求1所述的一种双载体表达体系，其特征在于，所述pUB‑toxic序列如SEQIDNO.4所示，所述pUB‑Exp序列如SEQIDNO.5所示.9.权利要求1‑8任意一项所述双载体表达体系在芽胞杆菌表达体系中的应用。10.权利要求1‑8任意一项所述双载体表达体系在芽胞杆菌中表达目标蛋白的方法，其特征在于，具体如下：(1)构建温敏载体pUB‑toxic和表达载体pUB‑Exp；(2)将待表达的目标蛋白编码基因克隆到pUB‑Exp中获得表达质粒pUB‑Enz；(3)通过遗传转化，先后将pUB‑Toxic和pUB‑Enz转化入芽胞杆菌中形成含有双质粒的转化子；(4)培养上述转化子，在升高培养温度、添加诱导剂和高浓度抗生素的筛选压力下，筛选出目标蛋白的高产菌株；(5)采用上述菌株进行目标蛋白的生产。2CN114214354A说明书1/12页一种双载体表达体系及其构建方法与应用技术领域：[0001]本发明属于基因工程和发酵工程领域，具体涉及一种双载体表达体系，及其在快捷构建酶制剂高产菌株中的应用。背景技术：[0002]特定酶制剂的获得通常需要依赖从自然界筛选得到的菌株进行发酵生产或者克隆其结构基因后连接适当表达元件进行异源表达。生产菌株较高的酶蛋白产量要求一定数目的基因拷贝。异源蛋白表达一般有两种形式，一为游离表达，另外一种为整合表达。在前