一种双顺反子翻译偶联表达载体及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115786377A(43)申请公布日2023.03.14(21)申请号202210876273.7(22)申请日2022.07.25(71)申请人南京工业大学地址211800江苏省南京市浦口区浦珠南路30号(72)发明人李莎王鑫沂徐虹王瑞罗正山邱益彬(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所32237专利代理师肖明芳(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12P21/02(2006.01)C07K14/435(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种双顺反子翻译偶联表达载体及其应用(57)摘要本发明公开了一种双顺反子翻译偶联表达载体，所述表达载体在pET‑28a(+)质粒上插入分子伴侣、新的核糖体结合位点和目的蛋白基因，构建成双顺反子翻译偶联表达载体。进一步地，本发明构建了基因工程菌，其为以E.coliBL21(DE3)为表达宿主，利用双顺反子翻译偶联表达载体，实现贻贝蛋白Mgfp‑3B与分子伴侣SUMO和/或TrxA的共表达，促进Mgfp‑3B正确折叠翻译从而以可溶性形式表达。本发明实现了在大肠杆菌中简便快捷地生产具有生物活性的可溶性贻贝蛋白，并且双顺反子表达载体避免了融合表达造成的酶切分子伴侣操作。此外本发明通过优化的发酵培养基与发酵工艺，使可溶性贻贝蛋白产量达到200‑300mg/L，简化了下游纯化工艺。CN115786377ACN115786377A权利要求书1/2页1.一种双顺反子翻译偶联表达载体，其特征在于，所述表达载体在pET‑28a(+)质粒上插入分子伴侣、新的核糖体结合位点和目的蛋白基因，构建成双顺反子翻译偶联表达载体，其中，分子伴侣基因位于插入的新的核糖体结合位点上游，贻贝蛋白基因位于插入的新的核糖体结合位点下游，所述目的蛋白基因为贻贝蛋白基因，所述分子伴侣为SMUO和TrxA中的任意一种或两种的组合。2.根据权利要求1所述的双顺反子翻译偶联表达载体，其特征在于，所述贻贝蛋白基因为Mgfp‑3B，其核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。3.权利要求1或2所述的双顺反子翻译偶联表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）对贻贝蛋白基因、分子伴侣SUMO、TrxA和SUMO‑TrxA基因编码区的克隆，其中在分子伴侣的下游引物和贻贝蛋白的上游引物均引入一个额外的核糖体结合位点；（2）贻贝蛋白Mgfp‑3B分别与分子伴侣SUMO、TrxA和SUMO‑TrxA进行连接并转入质粒pET‑28a(+)中构建成表达载体pET‑28a(+)‑SUMO‑Mgfp‑3B、pET‑28a(+)‑TrxA‑Mgfp‑3B和pET‑28a(+)‑SUMO‑TrxA‑Mgfp‑3B。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述编码基因SUMO的核苷酸序列如序列表3所示，其氨基酸序列如序列表4所示；所述编码基因TrxA的核苷酸序列如序列表5所示，其氨基酸序列如序列表6所示。5.一种重组基因工程菌株，其特征在于，所述重组基因工程菌株通过将权利要求1所述的双顺反子翻译偶联表达载体转入表达宿主E.coliBL21(DE3)中得到。6.权利要求1所述的双顺反子翻译偶联表达载体或权利要求5所述的重组基因工程菌株在制备可溶性贻贝蛋白上的应用。7.一种可溶性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将权利要求5所述的重组基因工程菌株经平板活化后接种至装有液体培养基的摇瓶中，35‑40℃，180‑220rpm培养8‑12h用作种子液；（2）将步骤（1）中的种子液按1‑10%的接种量接种至装有液体培养基的挡板摇瓶中，35‑40℃，180‑220rpm培养，在OD达到23时加入诱导剂，诱导剂终浓度0.1‑1mM，继续培养6‑600~10h结束。8.一种可溶性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将权利要求5所述的重组基因工程菌株经平板活化后接种至装有液体培养基的摇瓶中，35‑40℃，180‑220rpm培养8‑12h用作一级种子液；（2）将步骤（1）中的一级种子液按1‑10%的接种量接种至装有液体培养基的挡板摇瓶中，35‑40℃，180‑220rpm培养至OD达到56用作二级种子液；600~（3）二级种子液按1‑10%的接种量接种至发酵罐中进行发酵培养，发酵罐中装有发酵罐体积的40%‑60%的初始发酵培养基，初始条件为pH7.0±0.5，发酵过程中用质量浓度为10‑25%的氨水自动调节pH，使pH始终保持在7.0±0.5；温度35‑40℃；通过调节转速和通气，使得溶氧保持在20‑40%；（4）当初始碳源耗尽后，pH和DO会持续