大肠杆菌表达载体及其构建方法、应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004686A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211640578.4C12N15/66(2006.01)(22)申请日2022.12.20C12N1/21(2006.01)C12P13/22(2006.01)(71)申请人黑龙江金象生化有限责任公司C12R1/19(2006.01)地址152023黑龙江省绥化市北林区张维镇内(72)发明人卢煜曹国强张宇擎佟小雪周国旺李婧瑶邹德勇杨娜李雪姚杨雪(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211专利代理师邓宇(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/65(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称大肠杆菌表达载体及其构建方法、应用(57)摘要本发明公开了一种大肠杆菌表达载体及其构建方法、应用，属于基因工程技术领域。本发明解决了现有大肠杆菌载体在基因表达过程中表达效率低，从而导致其应用于色氨酸生产中色氨酸产率低的问题。所述大肠杆菌表达载体含有一个在大肠杆菌中具有功能的人工合成启动子序列、一段供外源基因插入表达的多克隆位点序列、一个人工转录终止序列、一个可以在大肠杆菌中进行基因克隆表达的抗性筛选标记。所述大肠杆菌表达载体可以实现基因的高效转录与翻译。本发明的大肠杆菌表达载体适用于色氨酸的生产。CN116004686ACN116004686A权利要求书1/1页1.一种大肠杆菌表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌载体应用于生产色氨酸，大肠杆菌表达载体含有一个在大肠杆菌中具有功能的人工合成启动子序列，含有一段供外源基因插入表达的多克隆位点序列，含有一个人工转录终止序列，含有一个可以在大肠杆菌中进行基因克隆表达的抗性筛选标记。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌载体，其特征在于，所述人工合成启动子核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌载体，其特征在于，所述供外源基因插入表达的多克隆位点序列为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的大肠杆菌载体，其特征在于，所述人工转录终止子核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。5.一种大肠杆菌表达载体的构建方法为：(1)、以pTH18kr作为载体骨架，将人工合成的启动子与终止子连接至pTH18kr上，获得的载体序列记为XYWa0；(2)、以野生型大肠杆菌MG1655为模板，利用GibsonAssembly方法，利用引物P1、P2扩增trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因序列，获得的目的片段记为P12；(3)、以步骤(1)所述的XYWa0做为模板，使用EcoRⅠ和KpnⅠ进行酶切，酶切后回收长度为3088bp的片段，以回收产物为模板利用引物P3、P4进行PCR扩增，获得的目的片段记为P34；(4)、将步骤(2)和(3)中所述的片段P12、P34使用SeamlessCloningKit进行连接，连接产物转化至野生型大肠杆菌MG1655感受态细胞中，使用卡那霉素抗性LB平板进行培养，筛选出单菌落，进行菌落PCR鉴定，使用引物为P5、P6，将扩增获得的长度为6954bpPCR产物进行测序，将测序鉴定正确的重组菌保藏，记为XYWa0717。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)使用的引物序列如下：P1：ggtggtgtaggatcctctagaattcatgcaaacacaaaaaccgactctcg；P2：ctgtgttctgtattacccgggtaccttaactgcgcgtcgccgc。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)使用的引物序列如下：P3：gatgaaagcggcgacgcgcagttaaggtacccgggtaatacag；P4：cgagagtcggtttttgtgtttgcatgaattctagaggatcctacac。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)使用的引物序列如下：P5：agcgaaagagagactggcc；P6：caactgttgggaagggcga。9.权利要求1所述的大肠杆菌表达载体在发酵生产色氨酸中的应用。2CN116004686A说明书1/4页大肠杆菌表达载体及其构建方法、应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，涉及一种菌类的表达载体及其构建方法。背景技术[0002]大肠杆菌的遗传背景清楚，经常会被用作进行大规模发酵培养，它的主要表现在表达周期短、操作相对简单且可利用的表达载体数量较多，但在基因表达的过程中，也存在表达效率不高而导致产率低等问题。影响基因表达效率的因