多重PCR检测六种腹泻病毒用引物探针组.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108034762A(43)申请公布日2018.05.15(21)申请号201711395100.9(22)申请日2017.12.21(71)申请人北京卓诚惠生生物科技股份有限公司地址102206北京市昌平区科技园区回龙观镇生命园路29号1幢B266室(72)发明人王雷白晓园陶金程张志强(74)专利代理机构北京英创嘉友知识产权代理事务所(普通合伙)11447代理人耿超王浩然(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表4页(54)发明名称多重PCR检测六种腹泻病毒用引物探针组(57)摘要本公开涉及一种多重PCR检测六种腹泻病毒用引物探针组和及检测方法，所述六种腹泻病毒为轮状病毒、诺如病毒、星状病毒、札如病毒、腺病毒和博卡病毒。本公开还提供了一种多重荧光定量PCR检测六种腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了腹泻病毒检测的敏感性、特异性和简便性。CN108034762ACN108034762A权利要求书1/2页1.多重PCR检测六种腹泻病毒用引物探针组，其特征在于，包括组分A和组分B，其中，所述组分A包括：SEQIDNO.1所示核苷酸序列的轮状病毒上游引物，SEQIDNO.2所示核苷酸序列的轮状病毒下游引物，具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的轮状病毒探针，所述轮状病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.4所示核苷酸序列的诺如病毒上游引物，SEQIDNO.5所示核苷酸序列的诺如病毒下游引物，具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的诺如病毒探针，所述诺如病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.7所示核苷酸序列的星状病毒上游引物，SEQIDNO.8所示核苷酸序列的星状病毒下游引物，具有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的星状病毒探针，所述星状病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；其中，所述组分B包括：SEQIDNO.10所示核苷酸序列的札如病毒上游引物，SEQIDNO.11所示核苷酸序列的札如病毒下游引物，具有SEQIDNO.12所示核苷酸序列的札如病毒探针，所述札如病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；SEQIDNO.13所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，SEQIDNO.14所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，具有SEQIDNO.15所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.16所示核苷酸序列的博卡病毒上游引物，SEQIDNO.17所示核苷酸序列的博卡病毒下游引物，具有SEQIDNO.18所示核苷酸序列的博卡病毒探针，所述博卡病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。2.根据权利要求1所述引物探针组，其中，所述组分A和组分B中还分别含有阳性内质控引物探针，阳性内质控上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，阳性内质控下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示，阳性内质控探针的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示，所述阳性内质控探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。3.一种多重荧光定量PCR检测六种腹泻病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总核酸；(2)以所述总核酸为PCR模板，利用权利要求1或2所述的引物探针组对所述PCR模板进行多重荧光定量PCR扩增；其中，所述多重荧光定量PCR同时在两个体系中进行，2CN108034762A权利要求书2/2页在第一个体系中，利用所述组分A对所述PCR模板进行第一扩增，在第二个体系中，利用所述组分B对所述PCR模板进行第二扩增；(3)分别收集两个体系中FAM、VIC和CY5荧光通道信号。4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述检测方法还包括分别在两个体系中添加阳性内质控pET28a质粒模板。5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，所述引物探针组中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，两个多重荧光定量PCR的反应体系包括以下含量的各组分：25μL反应液中含1-3U的HotstarDNA聚合酶、20-60U的RNase抑制剂、100-300U的MMLV逆转录酶，浓度为20mM且pH为