牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106167837A(43)申请公布日2016.11.30(21)申请号201610784167.0C12Q1/68(2006.01)(22)申请日2016.08.31C12N15/11(2006.01)(71)申请人金宇保灵生物药品有限公司地址010030内蒙古自治区呼和浩特市鄂尔多斯西街58号(72)发明人王艳杰魏学峰刘国英范秀丽张贵刚周伟光关平原张七斤陈君彦韩志玲王秀明王云凌张宸张妍韩四娥羡东堡田志辉张燕红谯小燕(74)专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限公司11322代理人鲁兵(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表9页附图4页(54)发明名称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针(57)摘要本发明公开了一种用于检测I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。利用本发明的试剂盒对BVDV检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于I型、II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒和猪瘟病毒的鉴别，更可以实现I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的准确定量，可用于疫苗生产中原料和半成品检测、牛奶产品质检等领域。CN106167837ACN106167837A权利要求书1/2页1.用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物或TaqMan探针，依据牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的5’UTR区域基因的特异性保守序列作为检测序列设计得到，该检测序列的碱基如序列表中SEDIDNO：6所示。2.根据权利要求1所述的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，上游引物(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1所述的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，该TaqMan探针(BVDV-P)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。4.根据权利要求3所述的TaqMan探针，其特征在于：所述报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。5.用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物和权利要求1或3或4所述的TaqMan探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O7.5μL。7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还可包括标准品、阳性对照和阴性对照，所述标准品为含I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒PCR扩增产物片段的质粒转录RNA产物，所述阳性对照为I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒基因组RNA，所述阴性对照为不含牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。8.一种用权利要求5-7任一所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的定性、定量检测的方法，包括以下步骤：1)建立标准曲线：构建携带所述检测基因的重组质粒pCRTOPO-BVDVstandardplasmid，对鉴定正确的重组质粒进行转录，制备得到RNA标准品，将标准品稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝(copies)/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1或2所述引物和权利要求1或3或4所述TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1或2所述引物和权利要求1或3或4所述TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测；3)用得到的CT值或荧光信号的变化对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BV