鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104611468A(43)申请公布日2015.05.13(21)申请号201510076187.8(22)申请日2015.02.13(71)申请人广西壮族自治区动物疫病预防控制中心地址530001广西壮族自治区南宁市友爱北路51号(72)发明人郑敏曹慧慧孙文超韦显凯蒙振亩郑列丰苏娇秀梁晟李军(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人罗保康(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针(57)摘要本发明公开了一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据禽痘病毒基因组DNA中P4b基因序列设计特异性引物对和探针，建立了鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，本方法具有靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低，灵敏度高，可对产物进行定量，操作简便，自动化程度高，扩增和检测一步实现对鸭痘病毒快速准确检测并鉴定。CN104611468ACN104611468A权利要求书1/1页1.一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）针对鸭痘病毒P4b基因设计能够检测鸭痘病毒的特异性引物和探针序列；（2）采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一种荧光素标记探针序列；（3）将用于检测鸭痘病毒的引物和探针置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。2.根据权利要求1所述的鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的特异性引物对序列为：上游引物：5’-TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3’；下游引物：5’-TCCAGAATCTGGGACACTTTTACA-3’。3.根据权利要求1所述的鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的特异性探针序列为：5’-CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3’。4.根据权利要求1所述的鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃5min;然后95℃30sec,60℃30sec循环40次。5.一种用于鸭痘病毒的检测方法，包括权利要求1所述的针对鸭痘病毒检测的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针。2CN104611468A说明书1/6页鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鸭痘病毒检测方法，尤其涉及一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测鸭痘病毒的引物和探针。背景技术[0002]鸭痘病毒（duckpoxvirus）为痘病毒科（Poxviridae），脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae），禽痘病毒属（Avipoxvirus）的成员。鸭痘是由鸭痘病毒引起家鸭或野生水禽的一种病毒性传染病，临床表现为体表无羽毛部位出现散在的、结节状的增生性皮肤病灶（皮肤型），或上呼吸道、口腔和食管黏膜出现纤维素性坏死和增生性病灶（白喉型），也可能同时发生全身性感染。禽群发生温和性皮肤型鸭痘时，死亡率较低，但影响动物采食和生长；而发生全身性感染，特别是白喉型鸭痘，或者有并发感染或饲养管理差时，死亡率较高，可给养鸭业造成较严重的经济损失。过去，鸭痘主要在北美地区的麻鸭（mallardduck）、黑嘴天鹅（trumpeterswan）、北美斑鸭（mottledduck）、赤头鸭（redheadduck）和蓝翅鸭（blue-wingedteal）等野生水禽中被发现。近年来，我国部分地区的麻鸭饲养场也相续暴发鸭痘疫情，并造成较为严重的经济损失。[0003]据文献报道，鸭痘是由痘病毒引起的一种急性传染病。其临诊特征是在皮肤、口腔或眼睛上出现痘斑症状和病变：病初体温稍高，迟钝，食欲下降，产蛋下降或完全停止。鸭痘的病症有以下几种形式：1、皮肤型：在鸭的嘴角和与鸭喙连接的皮肤上、眼睑处皮肤上出现大小不等的结节状痘样疹，并经常汇集成较大的疣状结节：其他如跗跖关节以下的足部趾或蹼上，也会出现结节状痘样疹，此病例约占3％。2、口腔型：最初在口腔黏膜上现灰白色痘疹，在口角处有结节样疹痘疹逐渐变黄，后期形成溃疡，经10～15d愈合，不形成伪膜。3、眼型：病初有水样分泌物，后来逐渐成脓性结膜炎，常将上下眼睑黏、合在一起，严重时町导致一侧或两侧眼睛失明。一般鸭痘的病变除化脓外，痘样结节状病变干涸后成痂，痂脱落后留一下一