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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108330211A(43)申请公布日2018.07.27(21)申请号201710035406.7(22)申请日2017.01.18(71)申请人南京美宁康诚生物科技有限公司地址210032江苏省南京市浦口高新区星火路10号人才大厦辅楼201室申请人北京美康基因科学股份有限公司(72)发明人白冰范建王艳梅顾立江(74)专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨马鑫(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表3页附图5页(54)发明名称A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒及其用途(57)摘要本发明公开了一种A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒及其用途,本发明属于核酸检测技术领域。本发明的试剂盒内设有阳性对照、阴性对照以及用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物。使用本发明所公开的检测试剂盒,避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题,每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性,可实现一次反应同时检测三种引起腹泻的常见病原体,检测所需时间短,准确性高,为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。CN108330211ACN108330211A权利要求书1/2页1.A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒,试剂盒内设有阳性对照和阴性对照,其特征在于:该试剂盒内还设有用于检测人内标基因actin的引物及探针,以及用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体的多种引物及探针的混合物;其中,用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示,Taqman探针序列为SEQIDNO:3所示,荧光标记为ROX;用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示,Taqman探针序列为SEQIDNO:6所示,荧光标记为FAM;用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示,Taqman探针序列为SEQIDNO:9所示,荧光标记为HEX;用于人内标基因检测的引物序列分别为SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示,Taqman探针序列为SEQIDNO:12所示,荧光标记为Cy5。2.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒,其特征在于:还包括PCR反应缓冲液以及酶系,所述的酶系包括DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂。3.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒,其特征在于:所述的阳性对照为含有A组轮状病毒,星状病毒以及肠道腺病毒目的基因片段的质粒菌,所述的阴性对照为细胞培养液。4.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒,其特征在于:用于A组轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒和内标actin核酸检测时,各引物最终浓度为0.2μM,各探针最终浓度为0.1μM,逆转录酶的终浓度为2.4U/μL,RNA酶抑制剂的终浓度为0.32U/μL,DNA聚合酶的终浓度为0.1U/μL。5.如权利要求1-4任一项所述的多重荧光PCR检测试剂盒,其特征在于:用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒时,包括如下步骤:(1)按照反应管数,取PCR反应缓冲液、用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物和酶系混于一离心管中,于涡旋振荡器上振荡,分装备用;(2)将阴性对照液加入一个分装管中,取各样本的RNA加入对应反应管中;最后取出阳性对照加入另一反应管中,各反应管标记后离心,取出置荧光PCR仪中;(3)荧光RT-PCR反应条件:50℃保持25min逆转录,95℃保持5min热启动;95℃维持10s变性,55℃维持15s退火,72℃维持30s延伸,预扩增5个循环;95℃维持10s变性,60℃维持45s退火/延伸,采集荧光信号,共进行40个循环;(4)结果判定:阴性结果判定:如果样本在FAM通道,HEX/VIC通道和ROX通道扩增曲线均不成S型、Ct值为UNDET或者>35.00,内标Cy5通道扩增曲线呈S型且结果Ct值<30,则结果为阴性;若内标Cy5通道扩增曲线不呈S型或结果Ct值≥30,则应对样本进行复检;阳性结果判定:如果样本在FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33,则结果为人星状病毒阳性,如果样本在HEX/VIC通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33,则结果为肠道腺病毒阳性,如果样本在ROX通道扩增曲线呈S型且C