一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110938710A(43)申请公布日2020.03.31(21)申请号201911314371.6(22)申请日2019.12.19(71)申请人武汉中帜生物科技股份有限公司地址430075湖北省武汉市东湖技术开发区高新大道858号生物医药园A6-2栋(72)发明人李先强姜昕陈巨黄永伟彭伟(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)42222代理人彭劲松(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6844(2018.01)权利要求书2页说明书11页序列表5页附图2页(54)发明名称一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使轮状病毒和肠道腺病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。CN110938710ACN110938710A权利要求书1/2页1.一种轮状病毒和肠道腺病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：1）扩增反应液：含40mMTris-HCl(pH8.0)，12mMMgCl2，70mMKCl，15%DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2µM；其中扩增引物包括三对：轮状病毒、肠道腺病毒和人内参基因，具体的：（1）轮状病毒引物：RVA-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATTCTCATTCTCAGTGCG；RVA-F引物（5’-3’）：5’-GTTGGGTGCGATCAAGTGGA-3’；（2）肠道腺病毒引物：EAD-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGCCGATGTAGATGTTGCA；EAD-F引物（5’-3’）：TGGAACCCTCCAGTTTGTGG；（3）内参核酸引物：内参-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTCTAGAATTACCACAGT；内参-F引物（5’-3’）：CTGGTTGATCCTGCCAGTA；2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7RNA聚合酶和RnaseH；优选地所述逆转录酶为AMV或M-MLV；3）核酸提取试剂：细胞裂解液，购至美国Signosis公司，货号CL-0001；4）检测液：包含金探针，为胶体金颗粒标记的核酸探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：（1）轮状病毒特异探针（5’-3’）RVA-CES1：TAAAGGAATTAAAGTGAGTGttttTATCTATAGCTGGTGT；RVA-CES2：CAAACTTAGATTCATCTGTAttttTATCTATAGCTGGTGT；RVA-LES1：TCAATATCAACTAATGTAAAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；RVA-LES2：GAAGGAGAAATCCAAGAACGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；RVA-LES3：ACCATAGAAGTAGGAAACACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；（2）肠道腺病毒特异探针（5’-3’）EAD-CES1：ACTTCAACCCATTCTCGGGCttttCTATGTATCTGTGAGT；EAD-CES2：GCTCCTGGTCTTTACCCAGAttttCTATGTATCTGTGAGT；EAD-LES1：CGACTTCATCCCAAACTACGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；EAD-LES2：ACGCGGTGAGCGAATCTGTGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；EAD-LES3：GACGGCTACGACTGAATCCCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；（3）内参特异探针（5’-3’）内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；内参CES2：GCGCAAATTACC