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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106755576A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201611226553.4(22)申请日2016.12.27(71)申请人湖南新南方养殖服务有限公司地址410000湖南省长沙市长沙经济技术开发区盼盼路7号综合办公楼400-405房(72)发明人喻正军李增强石建廖娟红(74)专利代理机构北京风雅颂专利代理有限公司11403代理人马骁于洁(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表1页附图2页(54)发明名称一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途(57)摘要本发明公开了一种仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是根据猪轮状病毒vp7基因而研制的实时荧光RT-PCR试剂盒,包括针对猪轮状病毒vp7基因序列设计的Taqman荧光探针及引物,所述引物的序列如SEQIDNO:1以及SEQIDNO:2所示,所述荧光探针的序列如SEQIDNO:3所示。本发明的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的猪轮状病毒,并具有较高的灵敏度,特异性强和重复性优,可以实现大通量样品的检测。并且本发明的试剂盒检测结果快速高效,不会造成样品交叉污染,同时达到母仔猪同时监测的目的。CN106755576ACN106755576A权利要求书1/2页1.一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,包括扩增引物和特异性荧光探针,所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示:上游扩增引物RV73-f:5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’,其为SEQIDNO:1序列;下游扩增引物RV73-r:5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’,其为SEQIDNO:2序列;特异性荧光探针RV73-p:FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA,其为SEQIDNO:3序列,其中Y=T/C,FAM为荧光报告基团,TAMRA为非荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,所述上游扩增引物RV73-f、所述下游扩增引物RV73-r和所述特异性荧光探针RV73-p的摩尔比为2:2:1。3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,所述上游扩增引物RV73-f、所述下游扩增引物RV73-r和所述特异性荧光探针RV73-p在所述试剂盒中的终浓度均为0.1~0.4μM。4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH2O,所述阳性对照为含有猪轮状病毒vp7基因序列的克隆质粒pEASY-vp7,克隆质粒pEASY-vp7的终浓度为3.2×105copies/μL~3.2×107copies/μL。6.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,所述猪轮状病毒vp7基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.根据权利要求6所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒,其特征在于,所述克隆质粒pEASY-vp7采用以下方法制备得到:提取猪轮状病毒RNA,利用引物RV73-f和RV73-r一步法扩增得到猪轮状病毒vp7基因序列,通过TA克隆将该猪轮状病毒vp7基因序列连接至pEASY-T1载体,转化后筛选阳性克隆,测序正确的克隆质粒命名为pEASY-vp7。8.一种如权利要求1-7任一项所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)使用权利要求1-7任一项所述的实时荧光RT-PCR试剂盒进行扩增时,反应体系以20μL计为:荧光RT-PCR反应液(含酶):16μL;10μMSEQIDNO:1所示的上游扩增引物RV73-f:0.4~0.8μL;10μMSEQIDNO:2所示的下游扩增引物RV73-r:0.4~0.8μL;10μMSEQIDNO:3所示的特异性荧光探针RV73-p:0.2~0.4μL;RNA模板:2μL;ddH2O:补足至20μL;(2)实时荧光RT-PCR的反应条件为:50℃反转录30min;95℃预变性2min;95℃变性15Sec,60℃退火30S