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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108384895A(43)申请公布日2018.08.10(21)申请号201810429940.0(22)申请日2018.05.08(71)申请人北京佰鸥创投生物科技有限公司地址102206北京市昌平区科技园区超前路11号四幢一层117(72)发明人郑淑芸原霖陈亚娜(74)专利代理机构北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙)11498代理人王加岭杨静(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页附图2页(54)发明名称猪轮状病毒数字PCR绝对定量检测试剂盒(57)摘要本发明提供了一种猪轮状病毒微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒,该试剂盒包含1对特异性引物对和1条与特异性引物对配合使用的特异性探针,其核苷酸序列分别如SEQIDNo.1-3所示。本发明的试剂盒利用数字化PCR仪器可快速、特异、灵敏地检测猪轮状病毒,检测灵敏度低至1个拷贝。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉,无需标准曲线,可快速、直接、定量检测猪轮状病毒,非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测,适合大范围推广应用。CN108384895ACN108384895A权利要求书1/1页1.一种用于检测猪轮状病毒的特异性引物和探针组合,其特征在于,包括以下1对特异性引物对和1条分别与引物对配合使用的特异探针,其核苷酸序列分别为:F2:ACCATCTWCACRTRACCCTC;R2:GGTCACATAACGCCCC;P2:FAM-ATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA-BHQ1。2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备猪轮状病毒检测试剂盒或检测试剂中的应用。3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。4.如权利要求3所述的试剂盒,其为微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂;所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水,一步法ddPCR探针法预混液,探针法ddPCR微滴发生油,质控液,阴性对照和阳性对照。6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性对照为含有猪轮状病毒基因组RNA的提取液,阴性对照为无RNA酶蒸馏水。7.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述一步法ddPCR探针法预混液其900μL的配方为:500μL的2XOne-stepRT-ddPCRSupermixforprobes,上、下游引物分别为90μL,特异探针为40μL,引物和探针的浓度均为10μM,以及无RNase酶蒸馏水180μL。8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的工作程序为:(1)配制ddPCR反应液;ddPCR反应液20μl配方为:一步法ddPCR探针法预混液18μL,待测样品RNA模板为2μL。(2)制备微滴,然后将微滴转入PCR板,于PCR仪中进行扩增;(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中,检测微滴,分析数据,显示检测结果。9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,步骤(2)中PCR的扩增程序为50℃反转录10min;95℃预变性10min;94℃变性30sec,57~60℃退火60sec,共40个循环;98℃10min结束反应,每步都设置2.5℃/sec的降温速度。10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在食品卫生检验检疫中的应用。2CN108384895A说明书1/7页猪轮状病毒数字PCR绝对定量检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及试剂盒检测技术领域,具体的说涉及一种猪轮状病毒数字PCR绝对定量检测方法和检测试剂盒。背景技术[0002]猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是引起多种新生动物和幼龄动物腹泻的重要肠道病原之一,也是感染1~5日龄仔猪或断奶仔猪的常见病原。以厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征,引起仔猪的死亡,成年猪掉膘,饲料报酬降低,增加人工费和药费的开支等。若与传染性胃肠炎和大肠杆菌混和感染则病情加重,死亡率增高。因此在临床上需要一种能够快速诊断猪轮状病毒的检测方法。[0003]传统的猪轮状病毒检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)、间接免疫荧光实验(IFA)和间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)等。目前最常用核酸检测方法有反转录-聚合酶链反应实验(RT-PCR)和荧光RT-PCR(RealtimeRT-PCR)等实验。传统的猪轮状病毒检测方法存在需要使用高成本仪器设备,试验所需时间较长等不足。RT-PCR和RealtimeRT-PCR虽然较之以往方法具