用于检测A型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109234465A(43)申请公布日2019.01.18(21)申请号201811405230.0(22)申请日2018.11.23(71)申请人山东新希望六和集团有限公司地址266111山东省青岛市城阳区流亭街道双元路空港工业园长江路西(72)发明人李晓菲秦立廷陈婷孙爱荣魏笑笑(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图2页(54)发明名称用于检测A型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用(57)摘要本发明公开了一种用于检测A型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用，其中，引物的核苷酸序列如下：上游引物：5'GAATGCAGTTAAGACAAATGC3'，下游引物：5'GTTACTTGAAGGTCGTGATTG3'；探针的序列如下：5'FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ13'。本发明的有益效果是：使用本发明的试剂盒能够快速、准确地实现对A型猪轮状病毒的检测；本发明的试剂盒在3.18x102-3.15x109copies·μL-1模板范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR的100倍；特异性良好，与其他常见猪病病毒无交叉反应；重复性试验变异系数小于1.4%；与常规PCR方法相比，该方法对临床样品的阳性检出率更高；综上所述，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为A型猪轮状病毒的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手CN109234465A段。CN109234465A权利要求书1/2页1.用于检测A型猪轮状病毒的引物及探针，其特征在于，所述引物序列如下所示：上游引物：5'GAATGCAGTTAAGACAAATGC3'，下游引物：5'GTTACTTGAAGGTCGTGATTG3'；所述探针序列如下所示：5'FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ13'。2.用于检测A型猪轮状病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测A型猪轮状病毒的引物和探针；所述引物序列如下：上游引物：5'GAATGCAGTTAAGACAAATGC3'，下游引物：5'GTTACTTGAAGGTCGTGATTG3'；所述探针序列如下所示：5'FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ13'。3.根据权利要求2所述的用于检测A型猪轮状病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的PremixExTaq（ProbeqPCR）。4.根据权利要求2或3所述的用于检测A型猪轮状病毒的PCR检测试剂，其特征在于，所述水为TaKaRa公司生产的RNase-freeWater。5.一种制备检测A型猪轮状病毒的荧光定量PCR试剂盒，为含有权利要求2-4任一项所述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。6.如权利要求1所述引物及探针、或如权利要求2-4任一项所述检测试剂、或如权利要求5所述试剂盒，在检测A型猪轮状病毒或制备检测A型猪轮状病毒检测产品中的应用。7.用于检测A型猪轮状病毒的荧光定量PCR检测体系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：（1）设计合成引物和探针；其中，所述引物的核苷酸序列如下：上游引物：5'GAATGCAGTTAAGACAAATGC3'，下游引物：5'GTTACTTGAAGGTCGTGATTG3'；所述探针序列如下所示：5'FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ13'；（2）制备阳性质粒标准品；（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL5×All-In-OneRTMasterMix和10.5μLRNase-freeWater，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；以上下游引物通过常规PCR扩增A型猪轮状病毒目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。9.根据权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，优化后的反应条2CN109234