快速检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103602758103602758A(43)申请公布日2014.02.26(21)申请号201310521544.8(22)申请日2013.10.30(71)申请人西南民族大学地址610041四川省成都市武侯区一环路南四段16号(72)发明人兰道亮陈亚冰李键熊显荣符梅王长松华修国(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12Q1/06(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书4页说明书4页序列表1页序列表1页附图4页附图4页(54)发明名称快速检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用(57)摘要本发明公开了一种用于检测猪嵴病毒的SYBRGreen荧光定量试剂盒及应用，该试剂盒含有a)RNA裂解液，b)PrimeScript®RTEnzymeMixI，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R，e)SYBR®PremixExTaqII，f)标准阳性模板，g)阴性对照品等。与之前的RT-PCR试剂盒相比，本发明简化了操作步骤，缩短了反应时间，减少了污染几率，并且能够提高检测的准确度和速度，一个样本检测可在3个小时内完成。荧光定量PCR在扩增完成后可以直接通过标准曲线定量起始病毒的拷贝数，能为流行病学提供可靠信息，该试剂盒还可以应用于（抗）猪嵴病毒药物的研究，对生物制品进行定量检测及质量监控；应用前景十分广泛。CN103602758ACN10362758ACN103602758A权利要求书1/1页1.一快速定量检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括：a)RNA裂解液，b)PrimeScript®RTEnzymeMixI，c)逆转录反应液，d)定量引物F及Re)SYBR®PremixExTaqII，f)ROXReferenceDye,g)标准阳性模板，h)阴性对照品i)无菌双蒸水所述逆转录反应液含有5×PrimeScript®Buffer，OligodTPrimer，Random6mers引物，标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品，SYBR®PremixExTaqII液含有TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR®GreenI。2.根据权利要求1所述的猪嵴病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述引物F序列为5’-TGATGCGGAGCCTACTGAAC-3’,R序列为5’-GCTATGATGGTAAGGACGAAA-3’。3.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于灵敏度达到7.02×101copies/μl，完全可以满足猪嵴病毒的快速检测及定量的要求。2CN103602758A说明书1/4页快速检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及发明一种快速检测猪嵴病毒的SYBRGree实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可以用于猪嵴病毒病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。背景技术[0002]猪嵴病毒（Porcinekobuvirus,PKoV）是一种无囊膜正链RNA病毒，属小RNA病毒科，嵴病毒属。自2007年，猪嵴病毒在匈牙利被首次检测到后，很快在中国大陆、亚洲其他国家（包括泰国、日本、韩国）、南美的巴西及欧洲荷兰等国被发现，而且感染率均较高，从16.7%到99.0%不等。研究数据表明在具有腹泻症状的猪群中，阳性率明显高于无腹泻症状的猪群，可能暗示其对猪具有一定的致病性。[0003]尽管如此，猪嵴病毒是否与肠道疾病有关，现在尚无定论，关于致病机制方面的研究成果也未见报道。但是在猪粪样品中检出率较高，长期处于隐性感染状态，可能对宿主产生不利影响。相关报道指出，在对仔腹泻猪粪便样品的病原分子检测中，常引起腹泻的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均为阴性，少数轮状病毒为阳性，而猪嵴病毒的阳性率最高，因此，推测该病毒可能与仔猪腹泻有关。[0004]鉴于此，研发一种快速检测猪嵴病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可用于猪嵴病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。[0005]国内学者徐志文、赵勤等发明了一种检测猪嵴病毒的RT-PCR试剂盒，RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点。但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，并且电泳等PCR后的处理过程容易造成污染而出现假阳性，限制了