一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114807437A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210359161.4(22)申请日2022.04.06(71)申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号(72)发明人粟硕张乐天姜智文周子彤孙久萌盛守志(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200专利代理师强萌(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表3页附图3页(54)发明名称一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括热启动TaqDNA聚合酶、无酶水、PCR反应液、探针法荧光定量PCR配套Buffer，以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品。本发明的试剂盒实现了在一个PCR反应管中同时检测四种能够引起猪腹泻的病毒，并具有极佳的特异性和重复性，可直接应用于猪临床腹泻样品的常规实验室诊断，为猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的流行病学研究提供快速、准确的检测方法。CN114807437ACN114807437A权利要求书1/2页1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括热启动TaqDNA聚合酶、无酶水、PCR反应液、探针法荧光定量PCR配套Buffer，以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品；其中，所述PCR反应液含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物；用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：PEDV‑G1(F)如SEQIDNO.1所示；PEDV‑G1(R)如SEQIDNO.2所示；PEDV‑G1‑Probe如SEQIDNO.3所示；用于检测G2基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：PEDV‑G2(F)如SEQIDNO.4所示；PEDV‑G2(R)如SEQIDNO.5所示；PEDV‑G2‑Probe如SEQIDNO.6所示；用于检测猪A群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：RVA(F)如SEQIDNO.7所示；RVA(R)如SEQIDNO.8所示；RVA‑Probe如SEQIDNO.9所示；用于检测猪C群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：RVC(F)如SEQIDNO.10所示；RVC(R)如SEQIDNO.11所示；RVC‑Probe如SEQIDNO.12所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为带有G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段的标准品模板，所述阴性对照品为无核酶水。3.根据权利要求2所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准品模板为分别将G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段四种目的基因扩增，连入pMD18‑T载体，构建的重组质粒。4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒保存于‑20℃，并避免反复冻融。5.权利要求1‑4任一项所述的试剂盒在检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒基因中应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：步骤1)获取待检样品的cDNA：提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；步骤2)使用试剂盒中的四对qPCR引物和相应的TaqMan探针进行检测：将所述四对qPCR引物和相应的TaqMan探针置于qPCR反应体系中，以步骤1)中获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，收集荧光信号；2CN114807437A权利要求书2/2页步骤3)根据机器测算的荧光信号及Cq值判断样品中是否有PEDV‑G1(FAM)、PEDV‑G2(TexasRed)、RVA(CY5)、RVC(VIC)，Cq值＞3