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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992160A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202211207197.7(22)申请日2022.09.30(71)申请人倍生生物科技(深圳)有限公司地址518000广东省深圳市光明区凤凰街道塘尾社区恒泰裕大厦3栋3B-801(72)发明人陈钰王钧莹康康胡皓夫(74)专利代理机构深圳智趣知识产权代理事务所(普通合伙)44486专利代理师崔艳峥(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N15/65(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表(电子公布)附图4页(54)发明名称一种穿梭载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种穿梭载体及其构建方法和应用。所述穿梭载体包括大肠杆菌的质粒复制子和大肠杆菌抗性筛选基因;所述大肠杆菌的质粒复制子为R6K,所述大肠杆菌抗性筛选基因为rpsL基因或pheS基因;所述穿梭载体中不含温敏型复制子和sacB基因。本发明的穿梭载体能够降低对BAC和穿梭载体之间进行同源重组筛选的假阳性率,减少对温度的依赖,提高筛选的准确性和简化流程。不仅可用于大肠杆菌基因组的改造,还可用于在基因组外的遗传物质上引入特定点突变。CN115992160ACN115992160A权利要求书1/1页1.一种穿梭载体,其特征在于,所述穿梭载体包括大肠杆菌的质粒复制子和大肠杆菌抗性筛选基因;所述大肠杆菌的质粒复制子为R6K,所述大肠杆菌抗性筛选基因为rpsL基因或pheS基因;所述穿梭载体中不含温敏型复制子和sacB基因。2.根据权利要求1所述的穿梭载体,其特征在于,所述穿梭载体上含有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的穿梭载体,其特征在于,所述穿梭载体上含有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。4.一种重组微生物细胞,其特征在于,所述重组微生物细胞含有权利要求1~3任一项所述的穿梭载体。5.一种如权利要求1~3任一项所述的穿梭载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:使用环状聚合酶延伸克隆的方法将所述大肠杆菌的质粒复制子和所述大肠杆菌抗性筛选基因进行拼接后,通过电转化或化学转化的方法转化到大肠杆菌中。6.根据权利要求5所述的穿梭载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:使用环状聚合酶延伸克隆将引物对1~4的PCR产物进行拼接后,转化到大肠杆菌中;7.根据权利要求5所述的穿梭载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:使用环状聚合酶延伸克隆将引物对1~2和5的PCR产物进行拼接后,转化到大肠杆菌中;8.权利要求1~3任一项所述的穿梭载体或权利要求4所述的重组微生物细胞在大肠杆菌基因组改造中的应用。9.权利要求1~3任一项所述的穿梭载体或权利要求4所述的重组微生物细胞在大肠杆菌基因组外的遗传物质上引入特定点突变中的应用。2CN115992160A说明书1/9页一种穿梭载体及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域,特别涉及一种穿梭载体及其构建方法和应用。背景技术[0002]大肠杆菌及其衍生菌种是重要的生物工程菌种,其作为重要的模式生物,是生命科学研究的重要材料。而对大肠杆菌及其衍生菌种的研究离不开分子生物学的操作,在其基因组中引入特定点突变是研究基因功能的常规分子生物学操作,目前主要方法有基于CRISPR的基因编辑技术、基于lambda‑red的同源重组及基于大肠杆菌自有同源重组系统的方法。前两种方法都需要引入外源蛋白,因此较为复杂,而大肠杆菌自有同源重组系统又存在一定的局限性,如假阳性率高和要依赖温度筛选等,在一定程度上限制了其应用。[0003]含有大量基因组DNA片段的细菌人工染色体(BAC)和P1人工染色体(PAC)已成功用作转基因来创建剂量依赖性疾病的生物模型。BAC和PAC可以准确地引入点突变和/或小重排,在转基因技术中具有潜在价值。现有技术在BAC中引入小的改变,会产生高频率的点突变,该方法涉及原始BAC和提供突变的穿梭载体之间的同源重组,每个重组步骤都使用正向和/或反向筛选标记进行监测,这些标记是抗性基因、sacB基因、温敏型复制子等。现有技术中已经使用这种方法在BAC中引入了不同的点突变和外源基因,外源基因可以用作转基因生物的生产。sacB基因是解淀粉芽孢杆菌的左旋蔗糖酶基因,作为反向筛选标记,该基因阻止含有共整合BAC克隆在蔗糖上的生长,因此含有sacB基因的菌落在蔗糖上生长非常缓慢。sacB容易发生突变,突变后没有办法起到反向筛选标记的作用,造成假阳性率高。温敏型复制子使得质粒可以在低温(30‑33℃)的温度下繁殖,而在高温(43℃)时复制不足。现有技