一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115772540A(43)申请公布日2023.03.10(21)申请号202211608126.8(22)申请日2022.12.14(71)申请人南京医科大学地址211166江苏省南京市江宁区龙眠大道101号(72)发明人许蕊王小丽(74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218专利代理师傅婷婷徐冬涛(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）附图8页(54)发明名称一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用。一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA，所述的pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA含有3’ITRS‑DeRed‑5’ITRS元件，其中DsRed基因不含有BbsI识别位点，DsRed基因序列上、下游分别为pigggBac转座子3’和5'ITRS，3’和5'ITRS引入分别引入了BbsI和BsaI内切酶位点，且紧邻TTAA序列。利用本发明质粒构建果蝇基因组无缝编辑所需同源臂供体质粒，可以将质粒构建从多片段连接改为可以通过单酶切引入同源臂至载体，降低载体构建难度，提高成功率。CN115772540ACN115772540A权利要求书1/2页1.一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA，其特征在于所述的pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA含有3’ITRS‑DeRed‑5’ITRS元件，其中DsRed基因不含有BbsI识别位点，DsRed基因序列上、下游分别为pigggBac转座子3’和5'ITRS，3’和5'ITRS分别引入了BbsI内切酶位点和BsaI内切酶位点，且紧邻TTAA序列。2.根据权利要求1所述的用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA，其特征在于所述的pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA的骨架载体pGX‑attP‑DsRed为以M5‑ΔUAST‑Rpr‑FRT_DsRed质粒为基础，同义突变消除AmpR基因中含有的BsaI内切酶识别位点所得，M5‑ΔUAST‑Rpr‑FRT_DsRed质粒序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA，其特征在于所述的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA序列如SEQIDNO.1所示。4.权利要求1‑3中任一项所述的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA的构建方法，其特征在于包含以下步骤：(1)通过同义突变消除骨架载体M5‑ΔUAST‑Rpr‑FRT_DsRed中AmpR基因包含的BsaI内切酶识别位点获得pGX‑attP‑DsRed；(2)从载体pSHD‑DsRed中扩增获得含3’TR‑DeRed‑5’TR序列的片段，含3’TR‑DeRed‑5’TR序列的片段中3’TR‑DeRed‑5’TR序列直接与TTAA相连接，并在上下游分别引入Bsal和Bbsl酶切位点以及骨架载体同源序列，3’TR‑DeRed‑5’TR序列中DsRed基因上不存在BbsI识别位点；(3)步骤(1)获得的pGX‑attP‑DsRed载体经KpnI‑HF+SpeI双酶切，获得的片段与步骤(2)获得的3’TR‑DeRed‑5’TR序列通过多片段同源重组酶进行连接获得质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(1)通过overlap‑PCR引入同义突变GGG→GGT，通过上下游HindIII和ScaI酶切位点切除原载体骨架M5‑ΔUAST‑Rpr‑FRT_DsRed中包含BsaI酶切位点的片段，将酶切后的线性片段和点突变的片段通过单片段同源重组酶进行连接。6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(1)包含以下步骤：(I)HindIII‑HF+ScaI‑HF双酶切M5‑ΔUAST‑Rpr‑FRT_DsRed载体，回收长度为3318bp的长片段，命名为A；(II)获得含同义点突变的AmpR片段：以M5‑ΔUAST‑Rpr‑FRT_DsRed载体为模板，分别以X33+X28和X29+X35为引物，使用Q5高保真酶扩增获得长度为1220bp的片段B和长度为451bp的片段C；以等摩尔数混合的片段B和C为模板，以X33+X35为引物，使用Q5高保真酶扩增获得长度为1634bp的片段D；其中引物X33序列为ATTTAAGTGTATACTTCGGT，引物X28序列为TGGAGCCGGTGAGCGTGGTTCTCGCGGTATCATTGCA