一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108659129A(43)申请公布日2018.10.16(21)申请号201810476055.8G01N33/574(2006.01)(22)申请日2018.05.17(71)申请人新疆大学地址830046新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市天山区胜利路666号(72)发明人夏丽洁腾桥张富春李金耀(74)专利代理机构长沙星耀专利事务所(普通合伙)43205代理人许伯严(51)Int.Cl.C07K16/30(2006.01)C12N15/13(2006.01)C12N15/10(2006.01)A61K39/395(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图5页(54)发明名称一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用，本发明利用原核表达的GPC3融合蛋白免疫骆驼，提取骆驼脾脏组织中的RNA，以其为模板反转成cDNA，构建到噬菌体外衣壳蛋白的载体上，构建噬菌体展示文库，并计算库容及滴度。然后利用抗原-抗体亲和性原理，经三轮淘选，从该文库中筛选出与GPC3特异性结合的纳米抗体，进而获得该特异性抗体的基因，构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定，即得到所需要的纳米抗体。CN108659129ACN108659129A权利要求书1/1页1.一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，优选地，所述纳米抗体仅由重链组成，优选地，所述纳米抗体的分子量大小为13kD。2.编码如权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。3.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求2所述的基因。4.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒。5.一种检测GPC3的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的抗体。6.权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对GPC3基因进行原核表达，收集表达的融合蛋白His-GPC3并纯化；(2)将纯化后的融合蛋白His-GPC3免疫骆驼；(3)提取步骤(2)骆驼脾脏组织的RNA，以其为模板反转成cDNA，特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因；(4)将步骤(3)扩增到的基因经酶切后与pCANTAB5E质粒连接，转化至大肠杆菌TG1，获得VHH抗体库。(5)将辅助噬菌体M13KO7加入至上述VHH抗体库中，制备噬菌体展示文库，并对噬菌体展示文库进行滴度测定；(6)利用融合蛋白His-GPC3从噬菌体展示文库筛选出能够与GPC3特异性结合的纳米抗体，测序鉴定所述特异性结合的纳米抗体，获得该纳米抗体的基因。(7)构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定。7.根据权利要求5所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述骆驼为新疆双峰驼。8.根据权利要求5所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。9.根据权利要求5所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转化为电转化。10.脾脏权利要求1所述的纳米抗体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒或权利要求4所述的细胞在制备治疗癌症的药物中的应用，优选地，所述癌症为肝癌。2CN108659129A说明书1/9页一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，本发明还涉及该纳米抗体的制备方法和应用。背景技术[0002]肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。由于肝癌特别是原发性肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发，因此，寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。[0003]早期诊断和治疗是提高原发性肝细胞癌疗效的关键因素之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员，它参与调控细胞增殖、调控、粘附和迁移等过程。有研究显示GPC3原发性肝癌中特异性高表达，而在成人正常肝组织低表达或不表达。从而提示GPC3对肝癌诊断具有显著的灵敏性和特异性，可作为识别原发性肝癌(HCC)特异性肿瘤标志物。[0004]靶向治疗则使分子药物特异性结合到肿瘤细胞的某些特定的作用位点，选择性杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常组织与细胞，克服了