一种抗GPC3纳米抗体合成库及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004612A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202310089823.5C40B40/02(2006.01)(22)申请日2023.02.08C12R1/19(2006.01)(71)申请人广东工业大学地址510000广东省广州市东风东路729号(72)发明人赵肃清龚鑫苏静怡梁锦慧蒋诗玲(74)专利代理机构广州市科丰知识产权代理事务所(普通合伙)44467专利代理师王海曼(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/66(2006.01)C07K16/30(2006.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种抗GPC3纳米抗体合成库及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种抗GPC3纳米抗体合成库及其构建方法，旨在增加纳米抗体文库的序列多样性和结构多样性；其制备方法：以从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的基因为全合成抗体文库的参考模板，确定框架区域初始长度以及随机化位点；再进行PCR扩增得到初始模板的目的基因FR1‑FR4区域片段；依次制备FR1‑CDR1‑FR2新目的短片段N‑1、短片段N‑2、目的基因序列N3、新目的基因序列N4；再酶切目的片段N4，使用T4DNA连接酶将目的片段插入线性化pComb3xss噬菌粒中进行PCR反应，得连接产物，再进行电击转化，取细胞液培养过夜；其余复苏后的细胞液接种培养、重悬沉淀，分离后收集溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库；属于生物技术领域。CN116004612ACN116004612A权利要求书1/2页1.一种抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，依次通过包括下述方法：1)以从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的基因为全合成抗体文库的参考模板，确定FR1、FR2、FR3、FR4区域与CDR1、CDR2、CDR3区域的初始长度；FR1、FR2、FR3、FR4区域的氨基酸全部不变，将CDR1、CDR2、CDR3作为随机化位点，并且CDR3的氨基酸长度设计为13，17，21；2)将从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的菌株提取质粒后作为PCR的模板，进行PCR扩增得到初始模板的目的基因FR1‑FR4区域片段；3)设计2段随机化CDR区的引物；所述的2段随机化CDR区的引物为序列如SEQIDNO.3所示的引物3，序列如SEQIDNO.4所示的引物4，序列如SEQIDNO.4所示的引物4，序列如SEQIDNO.5所示的引物5，序列如SEQIDNO.6所示的引物6。4)利用步骤2)制备的初始模板的目的基因FR1‑FR4区域片段作为PCR的模板，采用引物3、引物4扩增得到FR1‑CDR1‑FR2新目的短片段N‑1；同时步骤2)制备的初始模板的目的基因FR1‑FR4区域片段作为PCR的模板，采用引物5、引物6得到FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4新目的短片段N‑2；5)最后利用新目的短片段N‑1和新目的短片段N‑2作为重叠延伸PCR的模板，采用引物1、引物2得到完整且CDR1、CDR2、CDR3区域都已经随机化的纳米抗体的目的基因序列N3；6)最后设计核苷酸序列所示的SEQIDNO.7和核苷酸序列所示的引物8，加上酶切位点，利用N3作为PCR的模板，采用引物7和8得到加上酶切位点的纳米抗体的新目的基因序列N4；7)将目的基因片段N4与pComb3XSS质粒进行sfiI酶切，酶切结束才用OMEGA胶回收试剂盒进行回收酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段；8)再用酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段作为模板，使用T4DNA连接酶将目的片段插入线性化pComb3xss噬菌粒中进行PCR反应；9)次日将未纯化的连接产物进行纯化得连接产物；10)取纯化后的连接产物加入大肠杆菌TGI感受态细胞中进行电击转化，将转化后的细胞悬液复苏培养后的取细胞液，稀释，加入到CA抗性LB平板中，用涂布板均匀涂布，倒置平板，在37℃培养箱中，培养过夜；次日，计算板上的克隆数；随机挑选20个单克隆，送上海生工进行菌落测序，同时进行菌液PCR，最终的构建的纳米抗体合成库实际库容为1×108cfu/mL；其余复苏后的细胞液用于构建噬菌体展示纳米抗体文；11)取复苏的菌液接种培养、重悬沉淀，分离后收集溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库，‑80℃保存。2.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，所述的参考模板的FR1区域为17个氨基酸长度，CDR1区域为7个氨基酸长度，FR2区域为17个氨基酸长度，CDR2区域为8个氨基酸长度