一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114957454A(43)申请公布日2022.08.30(21)申请号202210577795.7G01N33/68(2006.01)(22)申请日2022.05.25(71)申请人青岛农业大学地址266000山东省青岛市城阳区长城路700号(72)发明人曹志单虎秦志华尹德华(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师苏士莹(51)Int.Cl.C07K16/08(2006.01)C12N15/13(2006.01)C07K19/00(2006.01)C12N15/70(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N33/58(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表3页附图7页(54)发明名称一种抗CSFVE2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种抗CSFVE2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。本发明所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明利用所述纳米抗体CSFV‑E2‑Nb1与标记位点构建融合蛋白，利用所述融合蛋白作为一抗抗体，构建了一种检测猪血清中CSFV抗体的阻断法ELISA检测试剂盒。利用本发明所述检测试剂盒，检测方法操作简单，为后续将所述纳米抗体和所述融合蛋白应用于CSFV抗体检测的提供了关键的材料，可以简化生产工艺，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。CN114957454ACN114957454A权利要求书1/1页1.一种抗CSFVE2蛋白的纳米抗体CSFV‑E2‑Nb1，其特征在于，所述纳米抗体CSFV‑E2‑Nb1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码权利要求1所述纳米抗体CSFV‑E2‑Nb1的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种包含权利要求1所述纳米抗体CSFV‑E2‑Nb1和标记位点的融合蛋白。4.根据权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述标记位点包括生物素化标记位点Avitag。5.一种表达权利要求3或4所述融合蛋白的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的基础载体包括原核表达载体。6.权利要求3或4所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述重组质粒转入感受态细胞内，利用IPTG进行诱导表达，收集包涵体蛋白，纯化后进行所述标记位点的标记。7.权利要求1所述纳米抗体CSFV‑E2‑Nb1、权利要求3或4所述融合蛋白或权利要求5所述重组质粒在制备检测猪血清中CSFV抗体的试剂中的应用。8.一种检测猪血清中CSFV抗体的阻断法ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：CSFVE2重组蛋白和权利要求3或4所述融合蛋白。9.根据权利要求8所述阻断法ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗和TMB显色液。10.根据权利要求8或9所述阻断法ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述CSFVE2重组蛋白的工作液浓度为0.5μg/mL；所述融合蛋白的稀释比为1:8000。2CN114957454A说明书1/9页一种抗CSFVE2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗CSFVE2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用。背景技术[0002]猪瘟(Classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、高致死性传染病。欧美一些发达国家经过严格的净化措施宣布已经消灭了猪瘟，但是对于东亚、东南亚等一些发展中国家猪瘟仍然是养猪业的重要传染病，各国也在寻找不同将其消灭的方法。我国随着猪瘟兔化弱毒株疫苗的长期控制，现在猪瘟在我国主要以隐性感染为主，但也时有猪瘟发生的报道。[0003]自2018年8月3日首例非洲猪瘟(Africaswinefever，ASF)在沈阳被确诊以来，ASF已相继在我国多个省份发生。而CSF和ASF的临床症状和病理变化极其相似，会干扰彼此的诊断。根据巴西的防控经验，做好ASF的防控有利于CSF的净化，而做好CSF的免疫和防控有利于ASF的诊断和防控。加之目前ASF没有有效的疫苗和治疗措施，在此背景下，更加凸显了CSF控制和净化的重要性。应用准确快捷的能够区分野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断方法，通过阳性猪淘汰等手段逐步实现CSF在规模化猪场的净化是势在必行的。[0004]20世纪90年代，C.Hamers‑Casterman等人发现骆驼科(如美洲驼、单峰骆驼等)动物体内存在一种天然缺失轻链和CH1区的抗体，被称为重链抗体。克隆其重链可变区生产的单域抗体称为VHH(Variabledomainofheavychainof