BRCA1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110079868A(43)申请公布日2019.08.02(21)申请号201910211682.3(22)申请日2019.03.20(71)申请人上海思路迪生物医学科技有限公司地址201114上海市闵行区新骏环路158号2幢304室、404室、402室(72)发明人陈俊李夏静陈才夫李福根许青熊磊(74)专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人张国梁(51)Int.Cl.C40B50/06(2006.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书3页说明书14页序列表27页附图4页(54)发明名称BRCA1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒(57)摘要本发明涉及BRCA1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒。本发明提供一种BRCA1/2基因的扩增子文库构建方法，所述方法包括对样本中包含BRCA1/2基因区域进行靶向扩增，所述靶向扩增包括1)以所述样本为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增，以及3)以第二轮PCR扩增产物为模板，通过第三轮PCR扩增构建BRCA1/2基因的扩增子文库。本发明还提供用于构建BRCA1/2基因的扩增子文库和/或检测BRCA1/2基因变异的试剂盒。本发明的方法和试剂盒能够在一个试剂管中进行PCR反应，简单快速构建扩增子文库，显著降低了操作的繁琐程度和对检测样本的需求量，提高了测序数据的整体质量。CN110079868ACN110079868A权利要求书1/3页1.一种BRCA1/2基因的扩增子文库构建方法，所述方法包括对样本中包含BRCA1/2基因区域进行靶向扩增，所述靶向扩增包括1)以所述样本为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增，以及3)以第二轮PCR扩增产物为模板，通过第三轮PCR扩增构建BRCA1/2基因的扩增子文库。2.权利要求1所述的方法，其中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增仅进行1个循环。3.权利要求1-2任一项所述的方法，其中第一引物和第二引物分别为正向引物和反向引物，或分别为反向引物和正向引物。4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中第一引物和第二引物包含靶向BRCA1/2基因的特异性序列，任选地还包含接头和/或index序列。5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述样本包含野生型或变异BRCA1/2基因序列。6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR包括纯化步骤，例如通过磁珠进行纯化步骤，任选地所述第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR在一个试剂管中进行。7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中第一引物和/或第二引物包括下述一个或多个引物中靶向BRCA1/2基因的特异性序列：2CN110079868A权利要求书2/3页3CN110079868A权利要求书3/3页8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增包括在55℃-70℃退火30-180秒，任选地所述退火包括55℃-70℃之间的不同温度退火30-180秒。9.一种试剂盒，所述试剂盒包含容器，所述容器分别包含适合进行权利要求1-8任一项所述方法的PCR试剂，例如DNA聚合酶，引物，和PCR缓冲液。10.权利要求9所述的试剂盒，其用于构建BRCA1/2基因的扩增子文库和/或检测BRCA1/2基因变异。4CN110079868A说明书1/14页BRCA1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒技术领域[0001]本发明涉及基因检测文库构建方法和产品。具体而言，本发明涉及用于BRCA1/2基因变异检测的文库构建方法和试剂盒。背景技术[0002]耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(HumanGenomeProiect，HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化，通过测定人类基因组DNA的序列，探寻基因在染色体上的位置，明确基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，人类第一次在分子水平上全面认识自我。新一代测序技术催生了丰富多彩的基因组图谱。[0003]新一代测序技术又称大规模平行测序(massivelyparallelsequencing，MPS)，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序等。[0004]然而，有些研究并不需要对全基因组进行测序，而只需对特定的基因组区域进行研究。扩增子测序就是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，