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本发明涉及一种检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法和试剂盒。所述构建方法包括:获取样本的基因组DNA;对所述基因组DNA中的女性不孕不育基因进行扩增,构建检测女性不孕不育基因的文库;所述女性不孕不育基因包括33个。本发明能针对男性不孕不育的一个或者多个基因进行扩增并构建检测文库,该文库能够用于二代测序,实现二代测序在男性不孕不育基因检测中的应用,采用二代测序对男性不孕不育基因进行检测,优点包括:(1)通量高;(2)成本低;(3)效率高;(4)测序深度高。(5)可重复及可追溯性。