无创产前胎儿β 型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106755486A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201710044640.6(22)申请日2017.01.19(71)申请人人和未来生物科技（长沙）有限公司地址410000湖南省长沙市高新开发区文轩路27号麓谷钰园C2栋1101号(72)发明人王晓锋曾华萍宋卓(74)专利代理机构深圳鼎合诚知识产权代理有限公司44281代理人孙银行彭家恩(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书3页说明书15页序列表12页附图2页(54)发明名称无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒(57)摘要本发明公开了一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒。文库构建方法中，对母体外周血游离DNA片段连接特异性的接头，然后将接头连接产物预扩增产物分成两部分，分别独立地使用针对目标位点的上、下游引物进行两轮特异性扩增，能够高特异性地富集目标位点，显著提高引物扩增特异性。并且分别使用用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上、下游引物组进行两轮特异性扩增，能够高效、准确的计算胎儿游离DNA比例。对本发明的文库进行测序，能够准确、高效地检测β型地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。CN106755486ACN106755486A权利要求书1/3页1.一种无创产前胎儿β型地贫基因突变检测文库构建方法，所述文库用于通过高通量测序进行无创产前胎儿β型地贫基因突变的检测，其特征在于，所述方法包括：(a)对母体外周血游离DNA连接带有特异标签序列和任选的样本标签序列的接头序列；(b)使用预文库扩增引物序列对上一步的连接产物进行预文库扩增，其中所述预文库扩增引物序列与所述接头序列互补结合；(c)将上一步得到的预文库分为上游预文库和下游预文库，分别使用上游特异性引物组1和下游特异性引物组1对所述上游预文库和下游预文库进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，其中，所述上游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1；所述下游特异性引物组1包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1；(d)对所述上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，分别使用上游特异性引物组2和下游特异性引物组2进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2，其中，所述上游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的上游引物组2；所述下游特异性引物组2包括用于扩增β型地贫基因的下游引物组2以及计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2；并且，所述上游特异性引物组2相比所述上游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点，所述下游特异性引物组2相比所述下游特异性引物组1更靠近对应的扩增目标位点；所述上游特异性引物组2和所述下游特异性引物组2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列；(e)将所述上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2混合后，使用两端的通用引物进行扩增，得到可上机测序的文库。2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述上游特异性引物组1和下游特异性引物组1的5'端带有用于分离扩增产物的修饰，优选带有生物素修饰。3.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述上游特异性引物组1中针对特定目标位点的引物的3’端，与所述上游特异性引物组2中针对该目标位点的引物的5’端有10-15个碱基的重合；所述下游特异性引物组1中针对特定目标位点的引物的3’端，与所述下游特异性引物组2中针对该目标位点的引物的5’端有10-15个碱基的重合。4.根据权利要求1-3任一项所述的文库构建方法，其特征在于，所述用于扩增β型地贫基因的上游引物组1序列如SEQIDNO：1-7所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1序列如SEQIDNO：8-17所示；所述用于扩增β型地贫基因的下游引物组1序列如SEQIDNO：18-25所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1序列如SEQIDNO：26-35所示；所述用于扩增β型地贫基因的上游引物组2序列如SEQIDNO：36-42所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组2序列如SEQIDNO：43-2CN106755486A权利要求书2/3页52所示；所述用于扩增β型地贫基因的下游引物组2序列如SEQIDNO：53-59所示