一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113652444A(43)申请公布日2021.11.16(21)申请号202110764526.7(22)申请日2021.07.06(71)申请人集美大学地址361000福建省厦门市集美区银江路185号(72)发明人李志朋杨昊翌倪辉李利君陈哲昊吴晓琪朱艳冰姜泽东李清彪(74)专利代理机构厦门创象知识产权代理有限公司35232代理人王凤玲尤怀成(51)Int.Cl.C12N15/81(2006.01)C12N15/61(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法(57)摘要本发明提供了一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法，其包括：以法夫酵母的基因组为DNA模板，以crtYB为目的基因，设计相对应的sgRNA，使用sgRNA体外转录试剂盒对sgRNA进行PCR扩增；将上述扩增后的sgRNA与Cas9组合形成核糖核蛋白，核糖核蛋白再导入质粒中；将上述获得的质粒电转化法夫酵母，用抗性平板筛选，并经PCR基因序列验证，得到利用基因编辑构建的法夫酵母。由此通过CRISPRCas9编辑法夫酵母中的crtYB基因，将使其失去原有功能，并进一步对生物体造成影响。通过分析构建菌株中基因的变化以及生物体特征的改变，从而理解该基因在法夫酵母中的作用，为研究法夫酵母合成虾青素的机理提供重要帮助。CN113652444ACN113652444A权利要求书1/1页1.一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法，其特征在于，包括：(1)以法夫酵母的基因组为DNA模板，以crtYB为目的基因，设计相对应的sgRNA，使用sgRNA体外转录试剂盒对sgRNA进行PCR扩增；(2)将步骤(1)扩增后的sgRNA与Cas9组合形成核糖核蛋白，核糖核蛋白再导入质粒中；(3)将步骤(2)获得的质粒电转化法夫酵母，用抗性平板筛选，并经PCR基因序列验证，得到利用基因编辑构建的法夫酵母。2.如权利要求1所述的利用基因编辑构建法夫酵母的方法，其特征在于，步骤(1)中，crtYB基因的序列如SEQIDNO：1所示。3.如权利要求1所述的利用基因编辑构建法夫酵母的方法，其特征在于，步骤(1)中，sgRNA进行PCR扩增使用的引物为：正向引物：5’‑ATAGGAGAATGGGATGTGGA‑3’；反向引物：5’‑AAGAGTTGTATTCCAGAAAGGGAA‑3’。2CN113652444A说明书1/5页一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法技术领域[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法。背景技术[0002]虾青素是一种类胡萝卜素，呈粉红色，具有极强的抗氧化活性，是迄今为止自然界里发现的抗氧化性最强的物质，被誉为"超级抗氧化剂"。天然虾青素的来源主要是红法夫酵母和微藻(雨生红球藻)，雨生红球藻较难培养，需要适宜的光照、温度和空气等，培育所需时间较长。红法夫酵母是虾青素的主要生物来源，但由于虾青素是胞内色素，是一种与细胞生长相偶联的次级代谢产物，且红法夫酵母最适生长温度低，菌体生长缓慢，使得虾青素的产量也比较低。目前高产虾青素酵母菌株主要是通过反复多次诱变和筛选得到。然而，反复多次诱变会产生有毒的突变株且会产生抗药性，难以再进行深入研究。[0003]基因编辑技术是以特异性改变遗传物质靶向序列为目标的技术。近年来，锌指核酸酶、类转录激活因子效应核酸酶、规律成簇的间隔短回文重复和单碱基编辑技术的相继出现，不仅为基因功能研究提供了有力的工具，还为生命科学提供了新的技术方案。其中，CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点，成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。目前几乎还没有将基因编辑应用于法夫酵母方面的研究。发明内容[0004]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法。[0005]为此，根据本发明的实施例，提供了一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法，其包括：[0006](1)以法夫酵母的基因组为DNA模板，以crtYB为目的基因，设计相对应的sgRNA，使用sgRNA体外转录试剂盒对sgRNA进行PCR扩增；[0007](2)将步骤(1)扩增后的sgRNA与Cas9组合形成核糖核蛋白，核糖核蛋白再导入质粒中；[0008](3)将步骤(2)获得的质粒电转化法夫酵母，用抗性平板筛选，并经PCR基因序列验证，得到利用基因编辑构建的法夫酵母。[0009]根据本发明的实施例，crtYB基因是用于编码番茄红素环化酶的基因，而番茄红素环化酶是将线性的番茄红素转化为具有环状结构的类胡萝卜素的关键酶，是合成虾青素的重要步骤。