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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107400169A(43)申请公布日2017.11.28(21)申请号201710647036.2(22)申请日2017.08.01(71)申请人北京华安科创生物技术有限公司地址100085北京市海淀区上地开拓路5号A409(72)发明人史权威潘向辉李延虎杨子义(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君陈征(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/14(2006.01)A61K38/17(2006.01)A61K47/42(2017.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书2页说明书4页序列表2页附图1页(54)发明名称一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法(57)摘要本发明提供一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法,本发明方法是将大肠杆菌表达的、以包涵体形式存在的肿瘤血管阻断剂融合蛋白的发酵菌体通过高压均质机破碎、高速离心,得到粗制包涵体。用不同洗涤溶液洗涤,得到较净的包涵体,然后经过8M尿素变性溶解包涵体,离心取上清,再用透析法复性。复性后样品经过离子交换、分子筛柱纯化后,得到的目的蛋白SDS-PAGE电泳纯度和RP-HPLC纯度均能达到95%以上。本发明提供的纯化方法简便,成本低,易操作,易于产业化生产。CN107400169ACN107400169A权利要求书1/2页1.一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)破菌:能够表达肿瘤血管阻断剂融合蛋白的菌体加入溶解液搅拌破碎后,离心,取沉淀;(2)沉淀:沉淀经三步洗涤,收集最后一步洗涤后的沉淀,得粗制包涵体;(3)变性:沉淀加入变性液,重悬至复溶后,搅拌,离心,收集上清液;(4)复性:过滤上清液,加透析袋中,复性液透析复性;(5)纯化:柱层析,超滤浓缩置换溶液,排阻层析。2.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤(1)是菌体加入溶解液经过重悬、磁力搅拌溶解后,高压均质机破碎3次,得到破碎液,再高速离心,弃上清,收集沉淀。3.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,所述溶解液为pH8.0-8.5的20-50mmol/LTris-HCl溶液。4.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤(2)的三步洗涤是指:洗涤1:将破碎离心后收集的沉淀,用洗涤液A重悬使其完全复溶后,搅拌,离心,收集沉淀;所述洗涤液A为pH8.0-8.5的20-50mmol/LTris-HCl、2%Triton、150mmol/LNaCl溶液;洗涤2:洗涤1得到的沉淀,用洗涤液B重悬使其完全复溶后,搅拌,离心,收集沉淀;所述洗涤液B为pH8.0-8.5的20-50mmol/LTris-HCl、1%Triton、2M尿素的溶液;洗涤3:洗涤2得到的沉淀,用洗涤液C重悬使其完全复溶后,搅,离心,收集沉淀;所述洗涤液C为pH8.0-8.5的20-50mmol/LTris-HCl溶液。5.根据权利要求4所述的纯化方法,其特征在于,洗涤1、洗涤2和洗涤3中,所述的搅拌均是在2-6℃环境下磁力搅拌2-3小时;然后2-6℃、6000-10000g离心10-30min,收集沉淀。6.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤(3)所述变性液为pH8.0-8.5的20-50mmol/LTris-HCl、8M尿素、15mmol/LDTT溶液;沉淀加入变性液后,使沉淀中总蛋白量的终浓度为1-2mg/mL;所述的搅拌是在2-6℃环境下磁力搅拌12-18小时;然后2-6℃、6000-10000g离心10-30min,收集上清液。7.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤(4)用0.45μm的滤膜过滤上清,在4℃下磁力搅拌,复性液透析复性45-50小时;所述复性液为pH8.0-8.5的20-50mmol/LTris-HCl溶液。8.根据权利要求1-7任一所述的纯化方法,其特征在于,步骤(5)的纯化步骤为:1)阴离子交换柱层析:先用平衡溶液A充分平衡柱子,使电导和pH值达到和平衡溶液A一样值;将复性过滤后样品以50-100ml/小时线性流速上柱,收集穿液;待紫外吸收值基线平衡后,然后用洗脱溶液A线性梯度洗脱8个柱体积;收集洗脱峰1、洗脱峰2;紫外吸收基线为零时停止收集;再分别用清洗溶液A和清洗溶液B清洗柱子2个柱体积后,用纯化水冲洗柱子;2)超滤浓缩置换溶液:阴离子交换所收集目的蛋白峰洗脱峰1用10KDa超滤管浓缩并置换溶液至2ml;3)分子筛排阻层析:先用平衡液B充分平衡柱子,使电导和pH值达到和平衡溶液B一样值;将超滤浓缩置换溶液后样品上柱,收集目的蛋白峰;紫外吸收基线为零时停止收集。9.根据权利要求8所述的纯化方法,其特征在于,平衡溶液