一种纯化非对称融合蛋白的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114805473A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210424493.6(22)申请日2022.04.21(71)申请人盛禾（中国）生物制药有限公司地址210046江苏省南京市经济技术开发区兴建路5号(72)发明人吴崇兵顾海涛姜晓玲殷刘松(51)Int.Cl.C07K1/16(2006.01)C07K19/00(2006.01)权利要求书1页说明书10页附图1页(54)发明名称一种纯化非对称融合蛋白的方法(57)摘要本发明提供了一种纯化非对称融合蛋白的方法，该方法包括平衡、上样、再平衡、淋洗、洗脱等步骤。本发明通过改进纯化条件，对样品pH、样品电导、淋洗液、洗脱液等进行考量和筛选，得到了适用于非对称融合蛋白的纯化工艺，工艺过程中各成分分离度好，去除杂质的效果较好，最终得到了纯度高、回收率高、稳定性好的非对称融合蛋白，有利于提高产品的质量控制水平及药物稳定性。CN114805473ACN114805473A权利要求书1/1页1.一种纯化非对称融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)平衡：在层析柱中加入不小于1个柱体积的平衡缓冲液，所述平衡缓冲液含40‑60mM的钠盐溶液；(2)上样；(3)再平衡：在层析柱中加入不小于1个柱体积的平衡缓冲液，所述平衡缓冲液含40‑60mM的钠盐溶液；(4)淋洗：在层析柱中加入2‑12个柱体积的淋洗缓冲液，所述淋洗缓冲液含170‑300mM的钠盐溶液；(5)洗脱：在所述层析柱中加入2‑12个柱体积的洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液含310‑400mM的钠盐溶液；其中，平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的pH值为4.5‑5.5。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(4)淋洗步骤中，在所述层析柱中加入2‑10个柱体积含175‑250mM钠盐的淋洗缓冲液；和/或，所述(5)洗脱步骤中，在所述层析柱中加入2‑10个柱体积含310‑370mM钠盐的洗脱缓冲液。3.根据权利要求1‑2中任一项所述的方法，其特征在于，所述层析柱的填料选自CaptoSImpAct、FractogelCOO(M)、NuviaHR‑S、DiamondSPMustang中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的缓冲体系中的钠盐溶液选自乙酸钠‑乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液选自乙酸钠‑乙酸，pH为4.5‑5.5或磷酸缓冲液，pH为5.5‑6.5；和/或，所述淋洗缓冲液选自乙酸钠‑乙酸，氯化钠浓度为175‑250mM，pH为4.5‑5.5或磷酸缓冲液，氯化钠浓度为175‑250mM，pH为5.5‑6.5；和/或，所述洗脱缓冲液选自乙酸钠‑乙酸，氯化钠浓度为325‑400mM，pH为4.5‑5.5或磷酸缓冲液，氯化钠浓度为325‑400mM，pH为4.5‑5.5。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(2)上样步骤中上样pH为4.5‑6.5，电导为3‑17mS/cm；优选上样pH为4.5‑6，电导为4‑15mS/cm。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(2)上样步骤中载量小于100mg/mL，优选小于80mg/mL、小于60mg/mL或小于40mg/mL。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非对称融合蛋白为包括第一部分和第二部分的异源二聚体。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一部分为特异性结合肿瘤抗原或免疫检查点的靶向部分。10.根据权利要求8‑9中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二部分为包含免疫调节剂的部分。2CN114805473A说明书1/10页一种纯化非对称融合蛋白的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效提纯非对称融合蛋白，减少杂质的纯化工艺。背景技术[0002]细胞因子是小分子的蛋白质或糖蛋白，在特定条件下具有识别并杀死肿瘤细胞的能力而制备成药。但是细胞因子的药效往往与其剂量成比例，且分子量小，半衰期短，需要高剂量频繁地给药以维持一定的血药浓度才能确保抗肿瘤药效。但患者容易发生剂量限制性毒性和全身毒性。为降低毒性，人们研发出了抗体‑细胞因子融合蛋白。[0003]抗体‑细胞因子融合蛋白是指由靶向性重组抗体或抗体片段与细胞因子组成的融合蛋白。理论上，抗体‑细胞因子融合蛋白与细胞因子相比：a.携带等量细胞因子的抗体‑细胞因子融合蛋白分子量更大，可以提高体内稳定性，延长半衰期，降低血清清除率；b.减少给药次数，减少DLT和全身毒性；c.细胞因子富集在病变部位提高了病变部位的药物浓度，更有效的发挥细胞因子的免疫调节作用；