一种纯化融合蛋白的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115819608A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211220838.2(22)申请日2022.10.08(71)申请人盛禾（中国）生物制药有限公司地址210000江苏省南京市经济技术开发区兴建路5号(72)发明人顾海涛姜晓玲殷刘松(51)Int.Cl.C07K16/46(2006.01)C07K1/22(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种纯化融合蛋白的方法(57)摘要本发明提供了一种纯化融合蛋白的方法。本发明通过改进纯化条件，对层析填料种类、载量、淋洗缓冲液、洗脱pH等进行考量和筛选，纯化工艺去除多聚体的效果较好，蛋白回收率较高，最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白，有利于提高产品的质量控制水平及药物稳定性。CN115819608ACN115819608A权利要求书1/1页1.一种纯化融合蛋白的方法，其特征在于，所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQIDNO:1，对应轻链的氨基酸序列选自SEQIDNO:3，第二重链氨基酸序列选自SEQIDNO:2，所述方法包括以下步骤：步骤(1)，处理层析填料，上样；步骤(2)，使用淋洗缓冲液淋洗；步骤(3)使用洗脱缓冲液洗脱并收集融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中层析填料为ATProteinADiamond。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)上样载量在20mg/mL填料以内，优选在15mg/mL填料以内。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中淋洗缓冲液包含第一淋洗缓冲液和第二淋洗缓冲液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一淋洗缓冲液为15‑25mMNaAc‑HAc，500‑1000mMNaCl，pH为6.0‑7.0。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二淋洗缓冲液为40‑60mMNaAc‑HAc，pH为4.7‑5.3。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中洗脱缓冲液为40‑60mMNaAc‑HAc，pH为3.4‑3.8，优选pH为3.65‑3.75。8.根据权利要求1‑7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括用2‑4倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0‑1.4mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.0‑1.4mL/min进行上样，其中所述平衡缓冲液为10‑30mMPB，120‑160mMNaCl，pH为7.2‑7.6。9.根据权利要求1‑8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括用2‑4倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0‑1.4mL/min冲洗，然后用2‑4倍柱体积第一淋洗缓冲液以流速1.0‑1.4mL/min冲洗，最后用2‑4倍柱体积第二淋洗缓冲液以流速1.0‑1.4mL/min冲洗，其中所述平衡缓冲液为10‑30mMPB，120‑160mMNaCl，pH为7.2‑7.6，所述第一淋洗缓冲液为15‑25mMNaAc‑HAc，500‑1000mMNaCl，pH为6.0‑7.0，所述第二淋洗缓冲液为40‑60mMNaAc‑HAc，pH为4.7‑5.3。10.根据权利要求1‑9任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)使用等度洗脱法，优选包括用3‑5倍柱体积的洗脱缓冲液以流速1.0‑1.4mL/min洗脱。2CN115819608A说明书1/6页一种纯化融合蛋白的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效提纯融合蛋白，减少多聚体杂质的纯化工艺。背景技术[0002]融合蛋白是包括一种、两种或更多种源自不同天然存在的蛋白质或者工程化改造后的蛋白质的多肽被人为地组合以形成一种蛋白质的蛋白质，包括但不限于以下例举的形式：1、对于一条多肽链组成的融合蛋白，其由相同或不同的多肽彼此融合，以形成包含所述不同的多肽的一条多肽链；2、对于两条或以上多肽链组成的融合蛋白，其中任选的一条或多条多肽链由相同或不同的多肽彼此融合，以形成包含所述相同或不同的多肽的多肽链，这些多肽链以共价或非共价的形式彼此组合形成蛋白。[0003]多聚体是指以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中产生，由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响，从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠，暴露的相关区域相互作用引发聚集，形成多聚体。[0004]多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性，从而影响药效，更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应，从而影响了受体的健康。因此，多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质，药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要