预览加载中,请您耐心等待几秒...
1/10
2/10
3/10
4/10
5/10
6/10
7/10
8/10
9/10
10/10

亲,该文档总共11页,到这已经超出免费预览范围,如果喜欢就直接下载吧~

如果您无法下载资料,请参考说明:

1、部分资料下载需要金币,请确保您的账户上有足够的金币

2、已购买过的文档,再次下载不重复扣费

3、资料包下载后请先用软件解压,在使用对应软件打开

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108456655A(43)申请公布日2018.08.28(21)申请号201810155580.X(22)申请日2018.02.23(71)申请人深圳至博生物科技有限公司地址518000广东省深圳市龙华区观湖街道南大富社区虎地排120号锦绣大地10号楼5层502号(72)发明人杨涛隋昳(74)专利代理机构深圳市精英专利事务所44242代理人任哲夫(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A61K35/28(2015.01)A61K9/10(2006.01)A61P3/10(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图2页(54)发明名称间充质干细胞悬浮液及其制备方法与应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域,提供一种间充质干细胞悬浮液及其制备方法与应用。一种间充质干细胞悬浮液的制备方法,包括:获取间充质干细胞原代细胞;间充质干细胞原代细胞的培养扩增;及间充质干细胞悬浮液的制备。本发明还提供一种间充质干细胞悬浮液,利用上述间充质干细胞悬浮液的制备方法制备得到。本发明还提供一种间充质干细胞悬浮液的应用,将上述的间充质干细胞悬浮液用于治疗糖尿病的药物注射。CN108456655ACN108456655A权利要求书1/2页1.一种间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:包括:获取间充质干细胞原代细胞;间充质干细胞原代细胞的培养扩增:间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液,至细胞65~75%融合,移去培养上清液,然后添加第一消化液,消化0.5-2min,细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离,重新加入完全培养基重悬,按照1传1~1.5接种,培养4~5天后,细胞65~75%融合时以1:6~8的比例进行传代培养;及间充质干细胞悬浮液的制备:取间充质干细胞原代细胞的培养扩增中P4代细胞培养扩增48-96小时,且细胞融合不超过80%后,用第三消化液消化细胞并洗涤后用5%人白蛋白混悬,再加入生理盐水即可得到所需的间充质干细胞悬浮液。2.如权利要求1所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述第三消化液为0.25%胰蛋白酶-EDTA。3.如权利要求1所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述的进行离心分离为在800~1200转/分下离心6~10min。4.如权利要求1所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。5.如权利要求4所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞,所述获取间充质干细胞原代细胞包括:抽取骨髓液并稀释:用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液,混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液;细胞的分离与纯化:将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上,通过离心分离纯化单个核细胞群,然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀;及细胞扩增培养:将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬,按5×106/mL的密度进行接种并于35~40℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养;培养3天后首次换液,弃去未贴壁细胞,以后每3d更换培养液1次,共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。6.如权利要求4所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞,所述获取间充质干细胞原代细胞包括:抽取自体脂肪颗粒并剪碎:抽取自体脂肪颗粒,剔除可见微血管及肌肉组织,用PBS进行洗涤,然后将脂肪组织剪碎至糊状使其小于1mm3;细胞的分离与纯化:往糊状的脂肪组织中添加第二消化液进行消化,消化后过滤收集滤液,然后使用含有10%FBS的低糖DMEM培养基进行中和,再离心得到沉淀;及细胞扩增培养:往经过细胞的分离与纯化后得到的沉淀中加入无血清培养基,以1×610/mL的密度进行接种,并于35~40℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养;培养3天后首次换液,弃去未贴壁细胞,以后每3d更换培养液1次,共培养6天即可得到自体脂肪间充质干细胞原代细胞。7.如权利要求6所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述第二消化液为含有0.1%胶原酶I型和0.05%胰蛋白酶的无血清DMEM。8.如权利要求4所述的间充质干细胞悬浮液的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞,所述获取间充质干细胞原代细胞包括:2CN108456655A权利要求书2/2页处理脐带:取脐带并剪断,剪断后的脐带总长度大于15cm,用生理盐水清洗后,再用含2倍双抗生理盐水去除血渍,