制备脐带间充质干细胞的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106434547A(43)申请公布日2017.02.22(21)申请号201611173913.9(74)专利代理机构上海市海华永泰律师事务所(22)申请日2016.12.1731302代理人包文超(71)申请人重庆市干细胞技术有限公司地址400013重庆市渝中区中山一路97号(51)Int.Cl.10-31C12N5/0775(2010.01)申请人章毅中国干细胞集团上海生物科技有限公司陕西省干细胞技术有限公司苏州市干细胞技术有限公司上海市干细胞技术有限公司三亚市干细胞技术有限公司中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司(72)发明人章毅王莎萍陈亮王波权利要求书1页说明书7页附图2页(54)发明名称制备脐带间充质干细胞的方法(57)摘要一种制备脐带间充质干细胞的方法，步骤包括：按规范采集初生婴儿废弃脐带和脐带血；在安全稳定的环境下运输；按采集规范接收、登记建立档案；洗去大部分残留血液进行碎化处理；0.2w/v％胶原酶II消化；采用分步离心法获取脐带间充质干细胞；将获得的初代干细胞按5.0×104/cm2～1.0×105/cm2接种于培养容器；待底层贴壁细胞融合80％以上后进行消化，消化分散后的细胞传代接种于培养容器，最多传代扩增脐带间充质干细胞到第六代。本发明的方法以实现排除脐带个体差异性的影响，使得脐带间充质干细胞生产工艺全过程能够标准化、规范化、程序化，产品能被质量管理体系所控制。CN106434547ACN106434547A权利要求书1/1页1.一种制备脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：步骤1：按规范采集初生婴儿废弃脐带和脐带血，在距胎儿脐部近处3cm～5cm处用两把止血钳夹住，从中间剪断脐带，收集自断脐处至胎盘末端，将脐带放入含有保养液的密闭容器内；步骤2：在安全稳定的环境下运输，运输过程中不能直接和外界空气有接触，保证脐带在24小时内到达实验室；步骤3：按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源病毒的检测，保证脐带安全可靠和溯源；步骤4：48小时内用磷酸盐缓冲液洗去大部分残留血液，保留10v/v％～20v/v％以上的残留血液，进行碎化处理，获得2mm3～5mm3均匀组织块；步骤5：0.2w/v％胶原酶II，37℃恒温摇床上消化步骤4获得碎化组织2小时；步骤6：加入DMEM，采用分步离心法获取脐带间充质干细胞，弃去残余组织，所述的分步离心法的离心参数分别为：10min300rpm、15min1，800rpm、10min1，000rpm和10min1,000rpm；步骤7：将步骤6获得的原初代脐带间充质干细胞按5.0×104/cm2～1.0×105/cm2接种于盛有培养基体系的塑料培养容器，培养基体系为含有10v/v％胎牛血清的LG-DMEM；置37℃，5v/v％CO2培养箱培养，3天后换培养液，弃去非贴壁细胞，以后每2天更换培养液；步骤8：5天～10天待细胞达到80％～90％融合度，利用胰蛋白酶和EDTA·4Na联合消化法，轻轻吹打分散细胞；步骤9：将步骤8获得的细胞，按2.0×104/cm2～3.0×104/cm2密度接种体外扩增，扩增脐带间充质干细胞至需求的数量级；步骤10：将步骤9获得的间充质干细胞进行质量评估，包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、无菌检测、支原体检测。2.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于所述的人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV。3.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液含有青霉素10万单位/L和链霉素100mg/L。4.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于所述的步骤9最多传代扩增脐带间充质干细胞到第六代。5.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于所述的细胞表面标记物包括CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。6.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法用于建立脐带间充质干细胞生产规范。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的建立脐带间充质干细胞生产规范还包括建立标准、标准操作程序、质量管理体系建立和评估系统。2CN106434547A说明书1/7页制备脐带间充质干细胞的方法技术领域[0001]本发明涉及一种干细胞培养的方法，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的培养方法，以建立间充质干细胞制取的规范化方法。背景技术[0002]间充质干细胞用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞，这两类细胞都具有间充质干细胞共同的特点低免疫源性，特别是后者更为明显。脐带中组织结构简单，除了主要的大血管，其余均以结缔组织为主，造成了脐带间充质干细胞基本