间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108624557A(43)申请公布日2018.10.09(21)申请号201810560596.9(74)专利代理机构上海市海华永泰律师事务所(22)申请日2018.05.3131302代理人包文超(71)申请人章毅地址200051上海市长宁区虹桥路1191号9(51)Int.Cl.楼C12N5/0775(2010.01)申请人中国干细胞集团上海生物科技有限A61K35/28(2015.01)公司A61P9/00(2006.01)中国干细胞集团海南博鳌附属干细A61P9/10(2006.01)胞医院有限公司上海市干细胞技术有限公司重庆市干细胞技术有限公司陕西省干细胞技术有限公司苏州市干细胞技术有限公司三亚市干细胞技术有限公司(72)发明人章毅陈亮陆薇黄海权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用(57)摘要一种间充质干细胞外泌体的制备方法，使用无血清的条件培养基培养间充质干细胞若干小时，离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；再向含有外泌体的上清液采用的聚乙二醇分步离心法制得。本发明方法制得的外泌体表达特异性蛋白CD63，能有效改善心肌细胞的线粒体损伤，预防细胞凋亡，改善心肌细胞的功能，用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物。CN108624557ACN108624557A权利要求书1/1页1.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：使用无血清的条件培养基培养间充质干细胞若干小时，离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；再向含有外泌体的上清液采用的聚乙二醇分步离心法制得。2.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：收集间充质干细胞无血清培养后的上清液，采用含16w/v％聚乙二醇6000的第一种氯化钠溶液和含10w/v％聚乙二醇6000第二种氯化钠溶液分步纯化外泌体。3.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：使用无血清的条件培养基培养间充质干细胞若干小时，离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；向含有外泌体的上清液加入等体积含聚乙二醇6000的第一种氯化钠溶液，放置12小时以上，离心，收集沉淀重悬于磷酸缓冲液中，再次加入等体积的含聚乙二醇6000的第二种氯化钠溶液，放置4小时以上，离心，收集沉淀重悬于磷酸缓冲液，即为纯化后的外泌体；所述的第一种氯化钠溶液含16w/v％聚乙二醇6000；所述的第二种氯化钠溶液含10w/v％聚乙二醇6000。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于所述的第一种氯化钠溶液含有1M氯化钠。5.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于所述的第二种氯化钠溶液含有1M氯化钠。6.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于所述离心的条件为3,500g，30分钟。7.根据权利要求1～6之一所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于制得的外泌体表达特异性蛋白CD63。8.一种表达特异性蛋白CD63的外泌体，其特征在于按权利要求1～7之一所述的方法制得。9.根据权利要求7所述的外泌体作为活性成分制成药物在改善心肌细胞的线粒体损伤中的应用。10.根据权利要求7所述的外泌体作为活性成分在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。11.一种药物，其特征在于含有权利要求7所述的外泌体。2CN108624557A说明书1/4页间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种制取生物制品的方法，尤其涉及一种干细胞外泌体的制备方法，以及在在制备治疗心肌缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。背景技术[0002]心肌缺血后再灌注(ischaemia/reperfusion)损伤是指心脏供血的冠状动脉短时间部分或全部阻塞后，血管又重新畅通时，原缺血心肌组织发生进行性更加严重的病理损伤过程，甚至可发生严重的心律失常而导致猝死。损伤的具体表现为心肌细胞死亡、心律失常、心脏功能障碍，最终导致心脏衰竭。心肌在缺血期引起的细胞结构功能、能量代谢等一系列损伤性变化，在血管再通后表现得更为突出。[0003]随着心脏外科体外循环、冠状动脉手术、复杂先天性心脏病纠治术、心内直视手术、瓣膜置换术、溶栓术后以及心肌内侧支循环血量突然增加等情况下，都可发生心肌缺血后再灌注损伤。其发生机制目前认为主要与细胞内氧自由基的增加、钙离子超负荷、炎症作用和代谢障碍等有关。研究表明，患有急性心肌梗死的患者死亡率超过一半是由缺血再灌注损伤引起的。缺血性心脏病在全世界范围内有很高的