制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108795853A(43)申请公布日2018.11.13(21)申请号201810525167.8A61P21/00(2006.01)(22)申请日2018.05.28A61P37/00(2006.01)A61P27/02(2006.01)(71)申请人天津博雅秀岩生物技术有限公司A61P1/16(2006.01)地址300457天津市滨海新区开发区海通A61P9/00(2006.01)街3号亚力山大中心A楼A61P13/12(2006.01)申请人威海北大博雅物种多样性研究院有A61P3/10(2006.01)限公司A61P1/00(2006.01)(72)发明人王小武迟大明朱春颖郭春明A61P5/14(2006.01)许晓椿A61P17/00(2006.01)(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A01N1/02(2006.01)A61K35/28(2015.01)A61P19/02(2006.01)A61P19/04(2006.01)A61P19/08(2006.01)权利要求书2页说明书9页(54)发明名称制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞(57)摘要本发明涉及制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞。具体涉及用于犬胎膜间充质干细胞的细胞冻存液，制备犬胎膜间充质干细胞的方法包括以下步骤：消毒和清洗、消化处理、细胞培养、细胞传代、细胞冻存。本发明从犬胎膜制备间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果，并且所用的培养基能够大大提高制备干细胞的效率。所制得的间充质干细胞能够有益的治疗犬科动物的关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。CN108795853ACN108795853A权利要求书1/2页1.用于犬胎膜间充质干细胞的细胞冻存液，其中包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白、0.2～0.5％w/v特别是0.25％w/v右旋糖苷-40。2.一种犬胎膜间充质干细胞，其细胞纯度大于90％；该犬胎膜间充质干细胞是照包括以下步骤的方法制备得到的：(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面污血、杂质；(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(例如，以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，优选以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液；(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(例如60％)以后，利用消化酶(例如，在本发明中，如未特别说明，使用TrypLETMExpress)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(例如80％)后，即得P1代胎膜间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代(例如，本发明所用的TrypLETMExpress，其组成为：氯化钾200.0mg/L、磷酸二氢钾200.0mg/L、氯化钠8000.0mg/L、七水磷酸氢二钠2160.0mg/L、EDTA457.6mg/L、商品化量的rProtease；该TrypLETMExpress可以商业途径购自赛默飞世尔公司，其相关技术信息例如参见http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.346.html)；任选的(5)冻存：将步骤(4)所得胎膜间充质干细胞中添加细胞冻存液(例如以体积比1:1的量加入)于液氮中冷冻，备用。3.从犬的胎膜制备间充质干细胞的方法和/或冻存方法，该方法包括以下步骤：(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面