脂肪间充质干细胞的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110438072A(43)申请公布日2019.11.12(21)申请号201910790168.X(22)申请日2019.08.26(71)申请人广东唯泰生物科技有限公司地址528200广东省佛山市南海区桂城夏南路61号创越时代文化创意园一座8层(72)发明人刘小翠孙灿兴李静静赵蓝(74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司44100代理人许英伟(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A01N1/02(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图4页(54)发明名称脂肪间充质干细胞的制备方法(57)摘要本发明提供一种脂肪间充质干细胞的制备方法，涉及干细胞与再生医学领域。该脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。本发明的方法得到的脂肪间充质干细胞的数量多、纯度高、活性好。CN110438072ACN110438072A权利要求书1/2页1.一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脂肪组织消化液包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.02～0.05mg/mL，I型胶原酶0.4～0.6mg/mL，Ⅲ型胶原酶0.4～0.6mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基；所述含双抗的DMEM培养基中的双抗为0.5～1.0μg/mL的硫酸庆大霉素和0.5～1.0μg/mL的两性霉素B。3.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化步骤具体为：保持消化处理温度为36～38℃，将脂肪组织消化液和胰蛋白酶预热至36～38℃，向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液，混合均匀后震荡消化35～45min，转速为200～300r/min；加入胰蛋白酶，继续消化12～18min；消化完成后，离心4～6min，离心转速为1700～1900r/min，去除上清液收集沉淀。4.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脂肪组织预处理的具体步骤为：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗干净的脂肪组织离心4～6min，离心转速为1000～1500r/min，离心后去除上清液；将清洗后的脂肪组织剪碎至体积为0.1～1mm3的脂肪微粒。5.根据权利要求4所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织清洗液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为25～35μg/mL，两性霉素B的浓度为8～12μg/mL，占总体积48％～52％的红细胞裂解液。6.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述清洗步骤具体为：用PBS溶液清洗沉淀，离心4～6min，离心转速为1500～2000r/min，去除上清液收集沉淀，如此重复用清洗2～4次，用生理盐水重悬沉淀，过100μm筛网去除大块组织，离心4～6min，离心转速为1500～2000r/min，得到脂肪间充质干细胞。7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述采集的脂肪组织在运输过程中需要添加组织保护液进行密封冷藏，冷藏温度为2～8℃，所述组织保护液通过以下方法制备得到：将生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B混合均匀，其中硫酸庆大霉素的浓度为25～35μg/mL，两性霉素B的浓度为8～12μg/mL。8.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脂肪微粒在未使用时，需要分装至冻存管，加入冻存液进行冻存，所述冻存液的成分为：甘油、甘露醇和含有双抗的DMEM，甘油、甘露聚糖和含有双抗的DMEM的质量比为1:(2～3):(6～7)。9.根据权利要求1～8任一项所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述清洗步骤后设有培养步骤，所述培养步骤具体为：向清洗步骤中得到的脂肪间充质干细胞加入细胞培养液，取