预览加载中,请您耐心等待几秒...
1/10
2/10
3/10
4/10
5/10
6/10
7/10
8/10
9/10
10/10

亲,该文档总共40页,到这已经超出免费预览范围,如果喜欢就直接下载吧~

如果您无法下载资料,请参考说明:

1、部分资料下载需要金币,请确保您的账户上有足够的金币

2、已购买过的文档,再次下载不重复扣费

3、资料包下载后请先用软件解压,在使用对应软件打开

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108715861A(43)申请公布日2018.10.30(21)申请号201810388981.X(22)申请日2018.04.26(71)申请人上海科技大学地址200120上海市浦东新区华夏中路393号(72)发明人冯松杰江雯黄行许(74)专利代理机构上海申汇专利代理有限公司31001代理人翁若莹王婧(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)权利要求书1页说明书13页序列表19页附图6页(54)发明名称一种碱基编辑工具及其应用(57)摘要本发明提供了一种碱基编辑工具及其应用。所述的碱基编辑工具,其特征在于,包括:多拷贝的GCN4与D10A-Cas9连接形成的GCN4-D10A;胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI连于单链抗体scFv形成的scFv-APOBEC-UGI载体或胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI以及防止多聚化的热稳定性结构域GB1连于单链抗体scFv形成的scFv-APOBEC-UGI-GB1载体。以及靶向特异位点的sgRNA。本发明相较于普遍使用的碱基编辑工具,显著地增加了碱基编辑的窗口,进而扩大了碱基编辑在基因组的应用范围。CN108715861ACN108715861A权利要求书1/1页1.一种碱基编辑工具,其特征在于,包括:多拷贝的GCN4与D10A-Cas9连接形成的GCN4-D10A载体;胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI连于单链抗体scFv形成的scFv-APOBEC-UGI载体或胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI以及防止多聚化的热稳定性结构域GB1连于单链抗体scFv形成的scFv-APOBEC-UGI-GB1载体。2.如权利要求1所述的碱基编辑工具,其特征在于,所述的碱基编辑工具还包括sgRNA载体。3.如权利要求1所述的碱基编辑工具,其特征在于,所述的碱基编辑工具还包括靶向特异位点的sgRNA。4.如权利要求1所述的碱基编辑工具,其特征在于,所述的多拷贝的GCN4与D10A-Cas9连接形成的GCN4-D10A为10个拷贝的GCN4与D10A-Cas9连接。5.如权利要求1所述的碱基编辑工具,其特征在于,所述的与D10A-Cas9连接的多拷贝GCN4招募scFv-APOBEC-UGI或scFv-APOBEC-UGI-GB1载体,在sgRNA的引导下在靶向位点做碱基编辑,进而增加靶向位点碱基编辑的窗口和准确性。6.如权利要求1所述的碱基编辑工具在真核生物里做碱基编辑中的应用。7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,包括:用于引入提前的终止密码子来做基因敲除、用于产生随机突变用于蛋白进化,药物靶点筛选或者基因组调控元件筛选中的至少一种。2CN108715861A说明书1/13页一种碱基编辑工具及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种新型碱基编辑工具,属于基因编辑领域,更具体地说涉及基于CRISPR系统与碱基脱氨酶结合进行特异性碱基替换的工具。背景技术[0002]基因编辑是通过在DNA上特定位点引入序列改变,达到基因的敲除或者外源DNA片段插入的技术手段。目前可编程的核酸酶主要包括三种,早期的锌指核糖核酸酶(ZFN)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)系统和现在普遍使用的CRISPR-Cas9系统1。CRISPR-Cas9基因编辑系统操作简单,仅需改变sgRNA的靶向序列就能在新的靶向位点上进行基因编辑,因此被迅速广泛应用于基因功能研究,细胞或动物水平的疾病造模以及基因治疗2-7。[0003]在基因编辑过程中,尽管CRISPR-Cas9能基于同源重组(HDR)机制在供体模板DNA的介导下引入碱基突变或者片段的插入,进而获得感兴趣的突变或者达到基因修复的目的。但CRISPR-Cas9也会通过非同源末端连接(NHEJ)引入不可控的插入或缺失突变(indels)。两种修复机制之间的竞争也导致同源重组效率不高。为了提高碱基突变的效率,一种通过将胞嘧啶脱氨酶融合在dCas9蛋白上,在不引起双链断裂的情况下高效的获得碱基定点突变的工具被研发出来。这种新型工具被称为碱基编辑工具8-12。[0004]尽管碱基编辑技术近年才出现,但已经被广泛用于许多领域。比如利用BE3系统以碱基编辑方式成功修复了与乳腺癌相关基因TP53上的一个碱基突变,以及与阿兹海默症相关基因APOE4上的一个碱基突变8。碱基编辑工具在农作物中也具有碱基编辑效率,提供了一种新的育种策略13-15。由于碱基编辑工具能引起定点的突变,在sgRNA库的靶向作用下通过对内源基因主要结构或功能位点进行饱和突变,选取合适的筛选条件,可得到定向进化的蛋白。由于蛋白进化是在胞内进行,将碱基