一种小型化碱基编辑器及其构建方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927271A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211204191.4(22)申请日2022.09.29(71)申请人复旦大学地址200433上海市杨浦区邯郸路220号(72)发明人程田林张淑倩邱佳怡(74)专利代理机构上海科盛知识产权代理有限公司31225专利代理师褚明伟(51)Int.Cl.C12N9/78(2006.01)C12N9/22(2006.01)C12N15/55(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种小型化碱基编辑器及其构建方法与应用(57)摘要本发明涉及基因编辑技术领域，涉及一种碱基编辑器及其构建方法与应用。本发明通过将脱氧腺苷脱氨酶及变体融合于Cas12f1为代表的突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的腺嘌呤实现有效且高精度的A‑G碱基突变。通过本发明的方法获得的不同的插入位点为基础的融合蛋白，其可突变范围各有差异。本发明的碱基编辑器体积更小，且活性窗口多样化，可实现更广范围、更精细且安全性更高的A‑G单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。CN115927271ACN115927271A权利要求书1/1页1.一种碱基编辑器，其特征在于，为胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶置于基础dCasd12f或突变型核酸酶dCasd12f的N‑末端、内部不同位点或C‑末端的融合位点形成的融合蛋白miniABEs；所述基础dCasd12f的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种碱基编辑器，其特征在于，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*，所述TadA*的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；或，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*突变体，其中，TadA*突变体是指TadA*的V106W、V82G、K20AK21A、F148A突变；或，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*或TadA*突变体的5’和3’分别添加NLS序列和linker序列后获得NLS‑TadA*‑linker，所述NLS‑TadA*‑linker置于dCasd12f的N‑末端、C‑末端或内部的融合位点融合形成的融合蛋白miniABEs‑8e；NLS‑TadA*‑linker的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。3.根据权利要求1所述的一种碱基编辑器，其特征在于，所述突变型核酸酶dCasd12f是指对基础dCasd12f进行D143R‑T147R‑E151A点突变组合，获得基于dCasd12f点突变的蛋白；所述基础dCasd12f或突变型核酸酶dCasd12f内部不同的插入位点包括第128和130位融合位点。4.根据权利要求1所述的一种碱基编辑器，其特征在于，为在dCasd12f的N‑末端、内部不同位点或C‑末端引入酶切位点SpeI‑BamHI‑Xba，并融合不同的胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶，获得的融合蛋白miniBEs；优选地，为dCasd12f的N‑末端、内部不同位点或C‑末端引入酶切位点SpeI‑BamHI‑Xba，并融合TadA*‑TadA*后，获得的融合蛋白miniABEs‑2‑8e；TadA*‑TadA*的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。5.权利要求1‑4中任一所述的一种碱基编辑器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将脱氧腺苷脱氨酶和dCasd12f不同位点融合，构建得到碱基编辑器；优选地，将脱氧腺苷脱氨酶5’和3’分别添加NLS序列和linker序列。6.权利要求1‑4中任一所述的一种碱基编辑器ABE的应用，其特征在于，所述碱基编辑器ABE介导A·T‑‑G·C突变，用于DNA水平特定位点特定碱基的突变。7.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1‑4中任一所述的碱基编辑器。8.一种载体，其特征在于，含有权利要求7所述的多核苷酸。9.一种宿主细胞，其特征在于，含权利要求1‑4中任一所述的碱基编辑器，或含有权利要求8所述的载体。10.一种试剂盒，其特征在于，包含用于构建权利要求1‑4中任一所述的碱基编辑器的试剂。2CN115927271A说明书1/7页一种小型化碱基编辑器及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及一种碱基编辑器及其构建方法与应用。背景技术[0002]CRISPR/Cas9为代表的新型基因编辑技术具有编辑效率高等优势，极大的推动了基因编辑技术的进步。2016年以来，研究者在CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)的基础上开发出多种DNA碱基编辑工具，可在DNA水平介导高效精准的点突变，且此过程中不会产生DNA双链断裂。目前报道的碱基编辑器主要有两种：胞嘧啶碱基编辑器(CBE，可介导C·G‑‑