一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115851804A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211277177.7C12R1/685(2006.01)(22)申请日2022.10.19(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人王斌周伟传潘力(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245专利代理师陆国宇(51)Int.Cl.C12N15/80(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N9/78(2006.01)C12N9/22(2006.01)C12N15/56(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用(57)摘要本发明提供了一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用。本发明采用碱基编辑系统中的胞嘧啶脱氨酶(AID)在黑曲霉中的编辑效率明显高于BEC系统中的使用大鼠胞苷脱氨酶(rAPOBEC1)，在以相同的靶标基因(黑曲霉中AnpyrG基因An12g03570中相同20bp的protospacer序列)编辑时，AID系统编辑效率为93.8％，BEC系统为43.8％，编辑效率提高了一倍以上，进一步提高了在黑曲霉中碱基编辑系统的效率Target‑AID系统在黑曲霉的分子育种、宿主改造等方面具有高效的应用，为黑曲霉基因工程改造提供了更加高效的编辑技术。CN115851804ACN115851804A权利要求书1/2页1.一种黑曲霉碱基编辑体系，其特征在于：包括将pFC332‑BEC质粒中的rAPOBEC1基因替换为AID基因得到的Target‑AID‑NGG质粒、将NGN部分突变序列构建到Target‑AID‑NGG质粒上的Target‑AID‑NGN质粒和将NRY部分突变序列构建到Target‑AID‑NGG质粒上的Target‑AID‑NRY质粒中的至少一种；所述的AID基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的NGN部分突变序列的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的NRY部分突变序列的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示的核苷酸序列或其互补序列。2.根据权利要求1所述的黑曲霉碱基编辑体系，其特征在于：所述的Target‑AID‑NGG质粒，能够识别PAM序列为NGG的编辑位点；所述的Target‑AID‑NGN质粒，是将NGN部分突变序列构建到nCas9基因上得到nCas‑NGN基因后得到的，能够识别PAM序列为NGN的编辑位点；所述的Target‑AID‑NRY质粒，是将NRY部分突变序列构建到nCas9基因上得到nCas‑NRY基因后得到的，能够更高效的识别PAM序列为NRY的编辑位点，可以不受PAM限制。3.根据权利要求1所述的黑曲霉碱基编辑体系，其特征在于：所述的黑曲霉碱基编辑体系通过插入sgRNA，实现对特定碱基的编辑；所述的sgRNA为能够识别特定protospacer序列的sgRNA。4.一种黑曲霉碱基编辑体系的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)合成AID基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(2)以pFC332‑BEC质粒为模板，获得Ptef和link‑nCas片段；(3)将pFC332质粒线性化，与AID基因片段、Ptef和link‑nCas片段连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target‑AID‑NGG载体。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于还包括如下步骤：(4)合成NGN突变序列片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(5)以Target‑AID‑NGG载体为模板，获得SpG‑2、SpG‑3和SpG‑4片段；(6)将pFC332质粒线性化，与NGN突变序列片段、SpG‑2、SpG‑3和SpG‑4连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target‑AID‑NGN载体；或(4)合成NRY突变序列片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(5)以Target‑AID‑NGG载体为模板，获得SpRY‑1、SpRY‑2、SpRY‑3和SpRY‑4片段；(6)将pFC332质粒线性化，与NRY突变序列片段、SpRY‑1、SpRY‑2、SpRY‑3和SpRY‑4连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target‑AID‑NRY载体。6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(6)所述的线性化为使用限制性内切酶PacI和PmlI双酶切；步骤(3)和步骤(6)所述的连接为使用In‑fusion方法将DNA片段连接成环形质粒。7.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)所述的获得片段的方法为使用引物332‑Ptef‑