一种从干细胞中提取外泌体的提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113943692A(43)申请公布日2022.01.18(21)申请号202111366615.2(22)申请日2021.11.18(71)申请人云南贺尔思细胞生物技术有限公司地址650101云南省昆明市高新区科园路101号细胞产业集群创新园2楼(72)发明人武丽娜(74)专利代理机构北京中政联科专利代理事务所(普通合伙)11489代理人陈剑杰(51)Int.Cl.C12N5/07(2010.01)A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种从干细胞中提取外泌体的提取方法(57)摘要本发明公开了该从干细胞中提取外泌体的提取方法，通过含血清的培养基培养后，首先采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，再用不含血清的培养基培养干细胞，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3CS‑NK‑B1和3CS‑NK‑B2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达；改变现有的采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后高速离心技术，使提取技术更加科学化，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。CN113943692ACN113943692A权利要求书1/1页1.一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间；2)然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；3)将步骤2)中的不含血清培养基中的干细胞进行分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质；4)将经过步骤3)中提取的外泌体提取液和含血清培养基液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；5)通过设置将步骤4)中含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；6)将步骤5)中收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集；7)冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。2.根据权利要求1所述的一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中不含血清的培养基为I型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3CS‑NK‑B1和3CS‑NK‑B2进行诱导生长。3.根据权利要求1所述的一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，其特征在于，所述步骤6)中将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用。4.根据权利要求1所述的一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，其特征在于，所述步骤5)中通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13‑1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离。5.根据权利要求1所述的一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，其特征在于，所述步骤6)中将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20～40小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储。6.根据权利要求1所述的一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，其特征在于，所述步骤7)中在进行冷冻储存时，需要在‑80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存。2CN113943692A说明书1/5页一种从干细胞中提取外泌体的提取方法技术领域[0001]本发明涉及干细胞中提取外泌体技术领域，具体为一种从干细胞中提取外泌体的提取方法。背景技术[0002]一种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究，外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。但是现有的干细胞外泌体提取的方法，一般是使用差速离心，由于样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，