犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108728408A(43)申请公布日2018.11.02(21)申请号201810525818.3A61P19/04(2006.01)(22)申请日2018.05.28A61P25/28(2006.01)A61P37/02(2006.01)(71)申请人天津博雅秀岩生物技术有限公司A61P27/02(2006.01)地址300457天津市滨海新区开发区海通A61P1/16(2006.01)街3号亚力山大中心A楼A61P9/00(2006.01)申请人威海北大博雅物种多样性研究院有A61P13/12(2006.01)限公司A61P3/10(2006.01)(72)发明人王小武迟大明朱春颖郭春明A61P1/00(2006.01)许晓椿A61P5/14(2006.01)(51)Int.Cl.A61P17/00(2006.01)C12N5/0775(2010.01)A01N1/02(2006.01)A61K35/28(2015.01)A61P19/02(2006.01)A61P19/08(2006.01)A61P21/00(2006.01)权利要求书2页说明书9页(54)发明名称犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基(57)摘要本发明涉及犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基。所述犬胎膜间充质干细胞是通过包括以下步骤的方法制备得到：消毒和清洗、消化处理、细胞培养、细胞传代、细胞冻存。本发明从犬胎膜制备间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果，并且所用的培养基能够大大提高制备干细胞的效率。所制得的间充质干细胞能够有益的治疗犬科动物的关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。CN108728408ACN108728408A权利要求书1/2页1.一种犬胎膜间充质干细胞，其细胞纯度大于85％；该犬胎膜间充质干细胞是照包括以下步骤的方法制备得到的：(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面污血、杂质；(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天时将培养容器从培养箱中取出，补加适量间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天进行一次全换液；(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％以后，利用消化酶将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90％后，即得P1代胎膜间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代；任选的(5)冻存：将步骤(4)所得胎膜间充质干细胞中添加细胞冻存液于液氮中冷冻，备用。2.从犬的胎膜制备间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面污血、杂质；(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天时将培养容器从培养箱中取出，补加适量间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天进行一次全换液；(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％以后，利用消化酶将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90％后，即得P1代胎膜间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代；任选的(5)冻存：将步骤(4)所得胎膜间充质干细胞中添加细胞冻存液于液氮中冷冻，备用。3.根据权利要求2的方法，步骤(1)中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-76，优选pH