细菌DNA提取试剂盒.doc

技术咨询电话：400-607-9999注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途细菌DNA提取试剂盒BacterialDNAout货号:M090073产品及特点本产品可以用于绝大多数革氏阳性和阴性细菌基因组DNA的快速提取。DNA纯净，OD260/280一般都在1.9左右，可直接用于PCR、酶切、杂交等实验。DNA产量一般在5-20ug/mL饱和菌液（108-109个细胞）。操作简单，整个过程约15分钟，容易放量操作。每次提取可以处理0.1-1.5mL的细菌，也可以使用菌落。价廉物美，与国外同类产品相比质量相当，但价格便宜。安全无毒，本试剂盒对人体无害，无腐蚀性和刺激性气味。规格及成分成份50次包装溶菌酶600mg溶液A30mL溶液B7.5mLRNaseA溶液750uL使用手册1份运输及保存常温运输，4℃保存。使用方法注意：溶液A和溶液B容易产生沉淀，溶液B比较粘稠，用前均需要放置在65℃预热使沉淀溶解、粘稠度降低，用前充分摇匀。一:对革氏阴性细菌样品将0.1-1.5mL过夜培养的菌液转移到1.5mL塑料离心管中，12000-15000g室温离心1分钟沉淀细菌，弃上清。加入600uL预热的溶液A到细菌沉淀中，充分吹打均匀。再加入150uL预热的溶液B到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。由于溶液B比较粘稠，可以采取称量方法取用，150uL约等于150-160mg。也可以将1mL枪头剪去一截再吸取。也可以同时加入15uL的RNaseA溶液。65℃放置3-5分钟。如果室温放置，DNA产量会降低10-20%。加入200uL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。12000-15000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间层的白膜。加入1倍体积(约750uL)的异丙醇到上清液中，用手上下颠倒30秒混匀。此时一般将有絮状DNA沉淀出现。12000-15000g室温离心3分钟。此时管底将有微小DNA沉淀，小心弃上清，注意不要丟弃DNA沉淀。在离心管中加1mL75%乙醇，短暂震荡，12000-15000g室温离心3分钟，弃上清。重复上述操作一次。短暂离心，小心吸弃残留的液体（约50µL）。此步不要省略，否则残留的液体（含乙醇）将会影响DNA电泳、酶切很PCR等反应。立即加入50-100µLTE缓冲液充分溶解DNA沉淀。注意：由于基因组DNA较长并在沉淀时形成紧密复合物，充分溶解的时间远长于质粒DNA或PCR片段，有时需要长达数小时。如果在第3步没有加RNaseA溶液，或虽然加了但还担心有残留的RNA污染，可以在此时补加5-10uL的RNaseA溶液，保温30分钟。直接取5-10uL电泳检测DNA，其余放冰箱备用。二:对革氏阳性细菌样品将0.1-1.5mL过夜培养的革氏阳性细菌12000-15000g室温离心1分钟后,重悬于0.6mL溶菌液中（溶菌液配制:30mL超纯水+600mg溶菌酶，配制后最好分装成小管并放-20℃长期保存，每次只用一小管)，颠倒混匀5-10次后放37℃保温至少30分钟(有的革氏阳性菌种可能需更长时间，需要自己根据不同的细菌摸索)。12000-15000g室温离心10分钟，小心弃上清。后续处理接上面的革氏阴性细菌提取步骤中的第2步。三:其他注意事项可以直接使用细菌菌落提取DNA，操作时直接将细菌菌落挑入到溶液A中，后续操作同上。从单个菌落中提取到的DNA较少，所以只用10-30uLTE溶解。背景资料G+和G-细菌细胞壁比较细胞壁特性革氏阴性菌革氏阳性菌厚度10nm20-80nm细胞膜层数21肽聚糖（Peptidoglycan）含量10-20%>50%磷壁酸（Teichoicacid）无有脂及脂蛋白含量58%0-3%蛋白含量9%0%脂多糖（Lipopolysaccharide）含量13%0对青霉素敏感性低高对溶菌酶（Lysozyme）敏感性低高