第4章 原生质体培养及融合1.ppt

第四章原生质体技术植物细胞一般都有细胞壁和原生质体两大部分组成名词术语：亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些较小的原生质体，称为亚原生质体。它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是只有1条或少数几条染色体，具体情况有：原生质体原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生成为杂种植株的技术。第一节原生质体培养
一、原生质体培养的发展历史
要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体，即去除细胞
壁，得到完整的裸露细胞。
1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)一词。
1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效率极低，无法进行培养和再生。
1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量具有高度活性的原生质体。1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场，使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体培养也开始成为热门研究领域。
1971年，Takebe等首次将烟草叶肉原生质体培养成完整植株。
1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物，即水稻原生质体的再生植株。
1986年，Spangenberg等由甘蓝型油菜的单个原生质体培养得到再生植株。二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等方法，将基因导入原生质体，实现遗传转化。
3、利用原生质体培养中广泛发生的变异，选育新品种。4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作
研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞
器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗
传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。5、用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植株，利用其叶片、叶柄、
茎段等均可分离原生质体，但一定要选用幼嫩部分。
近年来，为了提高原生质体再生的频率，最常用的是以下几类
材料：
无菌试管苗的叶片
上胚轴和子叶
处于对数生长期的细胞悬浮系2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的种类和浓度。
目前主要使用的酶有：果胶酶类、纤维素酶类、半纤
维素酶类和崩溃酶等，有时还会使用蜗牛酶（见下表）。151）果胶酶类
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细胞从组织中释放出来。

常用的果胶酶商品制剂：
PectinaseSigma
MacerozymeR-10Japan
PectolyaseY-23Japan(价格昂贵)2）纤维素酶类
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其作用是降解细胞壁中
的纤维素，使原生质体释放出来。常用的商品酶制剂：
EA-867中科院上海植生所
CellulaseOnzukaR-10Japan
CellulaseOnzukaRSJapan（价格昂贵）
MeicelasePJapan
CellulaseUSA
Driselase（崩溃酶，具多种活性）Japan3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维素，主要商品制剂有：
HemicellulaseH-2125Sigma
RhozymeHP-150USA各公司生产的酶的效果不尽相同，使用时应予以注
意。必须控制好浓度、温度和处理时间，例如：

CellulaseOnzukaR-10Japan22h
CellulaseOnzukaRSJapan3-5h
（两种纤维素酶的活性大约差10倍）3、酶液的渗透压
原生质体的一个基本属性是渗透破损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。常用的稳定剂分为两类：
1）糖溶液系统
2）盐溶液系统
1）糖溶液系统
多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因对原生质体培养不利，很少使用。

2）盐溶液系统
主要使用：KCl、MgSO4•7H2O4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质体的稳定性，
保持原生质体的活性，促进细胞壁再生及细胞分裂等。
常用的质膜稳定剂有：葡聚糖硫酸钾、CaCl•2H2O、KH2PO4等。
MES：2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid，即2-氮吗啉乙