遗传学第4章 原生质体培养及融合配色.ppt

第四章原生质体培养及融合
名词术语：
原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是一个被质膜所包围的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些较小的原生质体，称为亚原生质体。
它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是只有1条或少数几条染色体，具体情况有：小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体(nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分细胞质。
微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生成为杂种植株的技术。原生质体第一节原生质体培养
一、原生质体培养的发展历史
要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体，即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。
植物原生质体培养研究中几个重要的成就：
1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)一词。
1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效率极低，无法进行培养和再生。甜菜
洋葱
萝卜
黄瓜1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量具有高度活性的原生质体。
1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场，使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体培养也开始成为热门研究领域。
1971年，Takebe等首次将烟草叶肉原生质体培养成完整植株。
1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物，即水稻原生质体的再生植株。
1986年，Spangenberg等由甘蓝型油菜的单个原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型）BACK随后，其它植物上也逐渐有原生质体再生植株成功的报道，包括粮食作物、油料作物、经济作物和一些药用植物。
据1993统计，已有49个科，146个属的320多种植物，都可经原生质体培养得到再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济作物为主，但已从一年植物生向多年生植物、从草本植物向木本植物、从高等植物向低等植物扩展。二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等方法，将基因导入原生质体，实现遗传转化。
3、利用原生质体培养中广泛发生的变异，选育新品种。4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。5、用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存.Aschemeofplantprotoplast三、原生质体的分离
1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原生质体，但一定要选用幼嫩部分。
近年来，为了提高原生质体再生的频率，最常用的是以下几类材料：
无菌试管苗的叶片
上胚轴和子叶
处于对数生长期的细胞悬浮系2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的种类和浓度。
目前主要使用的酶有：
果胶酶类
纤维素酶类
半纤维素酶类和崩溃酶等
有时还会使用蜗牛酶。.1）果胶酶类
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细胞从组织中释放出来。

常用的果胶酶商品制剂：
PectinaseSigma
MacerozymeR-10Japan
PectolyaseY-23Japan(价格昂贵)

2）纤维素酶类
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质体释放出来。常用的商品酶制剂：

EA-867中科院上海植生所
CellulaseOnzukaR-10Japan
CellulaseOnzukaRSJapan（价格昂贵）
MeicelasePJapan
CellulaseUSA
Driselase（崩溃酶，具多种活性）Japan3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维素，主要商品制剂有：
HemicellulaseH-2125Sigma
RhozymeHP-150USA
4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质
各公司生产的酶的效果不尽相同，使用时应予以注意。必须控制好浓度、温度和处理时间，