第五章 目的基因的获取、扩增与检测及相关技术-之3检测-zhl2-已修.ppt

第五章目的基因的获取、扩增与检测及相关技术1、物理化学方法
2、鸟枪法
3、化学合成法
4、基因文库
5、逆转录合成
6、PCR技术
7、凝胶电泳
8、酵母双杂交系统
9、杂交技术
10、生物芯片
11、DNA测序第三节目的基因的检测技术一、凝胶电泳（已讲）
二、PCR技术（已讲）核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）技术
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。1、原理
2、分类
3、杂交过程1、原理复性（1）Southern印迹杂交(Southernblotting)
DNA-DNA

★核酸杂交：
（基于碱基互补配对）

★蛋白质杂交：Western杂交其他：
组织原位杂交(Tissueinsituhybridization)
DNA-染色体DNA
斑点杂交(印迹)(dotblotting)
DNA-DNA(直接点样杂交)

DNA点阵、生物芯片DNA点阵（1）Southern印迹杂交
*是E.Southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（SouthernBlotting）。

*通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基因的存在及大小。Southern印迹法（a）分子杂交实验SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片
水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。放射自显影照片（2）Northern杂交（3）Western(印迹)杂交Southern和Western印迹法三种印迹技术的比较（4）菌落原位杂交菌落杂交
也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。
鉴定重组子。原位杂交法筛选DNA重组体图解检测重组体克隆的菌落杂交技术菌落原位杂交第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology探针(probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。杂种核酸分子：
彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。
DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系
DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。
核酸杂交常用几种膜的性能比较硝酸纤维素膜
不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。
应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。
RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：
1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用
2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。1、Southern(萨瑟恩)DNA印迹杂交

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。印迹转移前的凝胶处理：
分子量不同所需转移的时间不同；
浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进行碱变性
碱水解，DNA链断裂
单链（a）SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片
水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。在进行核酸印迹转移的时，
1.要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤1～2小时；
2.紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。