第五章目的基因的获取.ppt

第五章目的基因的获取化学合成法
PCR技术
筛选基因文库
转座子标签法
mRNA差别显示技术
生物信息技术分离和鉴定
酵母双杂交系统分离（一）化学合成法的单元操作将所要合成的寡核苷酸链的3’末端先以3’-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠、二氧化硅等连接，然后依次从3’-5’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中5’-OH用二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，3’-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，用甲基或氰乙基保护。亚磷酸三酯法合成过程1、小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段2、补丁延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段3、大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段（三）DNA化学合成的用途二、PCR技术获得目的基因三、筛选基因文库(genelibrary)（一）基因文库的容量和完备性例：人的单倍体DNA总长为2.9×109bp，基因文
库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。（二）理想基因文库条件（三）基因组文库的构建程序（四）基因组文库的构建程序3、DNA片段和载体的相连
直接连接、人工接头或同聚物加尾。（五）cDNA文库的构建cDNA文库
制备及筛选策略1、总RNA的提取2、mRNA的纯化（2）磁珠法纯化mRNAPolyATtractmRNA的分离纯化过程3、cDNA的合成cDNA第二链的合成置换合成法：获得的双链cDNA5’端也有几
对碱基缺失,但一般不影响编码区的完整.引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列,但操作比较复杂，Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序不利。4、双链cDNA的克隆（六）从基因组文库中筛选目的基因四、转座子标签法获得目的基因复制转座：在转座期间先复制一份拷贝，而
后拷贝转座到新的位置，原位置仍保留原转座
因子。
非复制转座：直接从原来位置上转座插入新
的位置，并留在插入位置上作用。（１）Ac自主性因子：有自主剪接和转座的功能
Ds非自主性因子：独立存在稳定，需要同一族自主性因子提供转座酶才有转座功能。玉米花斑的控制（二）转座子标签法（transposontagging）转座子标签法获得目的基因流程五、图位克隆（mapbasedcloning）获得目的基因染色体步移（ChromosomeWalking）1)用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置;
2)找到与目标基因紧密连锁的分子标记;
3)构建含有大插入片段的基因组文库(ＢＡＣ库或ＹＡＣ);
4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;
5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;
6)通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆;
7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;以一系列头尾相互重叠探针筛库，类似于从
分子标记序列开始通过一系列相互重叠的克
隆向目标基因的“行走”，故称为染色体步移。六、mRNA差别显示技术（mRNAdifferentialdisplay）获得差异表达的基因DDRT-PCR理论基础（3）5’端的随机引物（4）随机引物与锚定引物成对扩增DDRT-PCR操作步骤*差异分离目的基因程序随机-锚定引物PCR的产物电泳比较减法杂交(subtractivehybridization)七、酵母双杂交系统（two-hybridsystem）分离目的基因2.拆开DomainGAL4的DBdomain与ADDomain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。X基因和Y基因产物的相互结合，导致reportergene表达。重组质粒构建过程构建好的两质粒载体八、生物信息技术分离和鉴定目的基因2、通过蛋白家族的保守性分离目的基因作业：