目的基因的PCR扩增与检测.pptx

会计学一、实验目的：
熟悉PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作，了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因(jīyīn)（CYP6B6）。
二、实验原理：
PCR扩增是一种类似于DNA的天然复制过程，以待增的DNA为模板、在体外由引物介导的酶促合成特异性DNA片段的方法。PCR方法(fāngfǎ)体外扩增DNA的基本原理图示预变性(biànxìng)(双链DNA解链)
94C,5min（1）引物长度应为15~30个核苷酸，Tm可按下列简单公式(gōngshì)计算：
Tm=（G+C）x4+（A+T）+35-2n
（2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。
（3）G+C碱基的含量在45%~55%左右。
（4）两个引物在3端均必须与模板互补，5端可以不互补。
（5）引物自身连续互补碱基小于4个。
（6）引物之间连续互补碱基亦应小于4。循环参数：
①变性（denaturation）
变性是高温短时，94C，30s-1min。同时在第一轮循环前先进行94℃预变性5min，以便使模板DNA完全解链。
②退火（annealing）
实际(shíjì)使用的退火温度要比引物的Tm低5℃。退火温度在55~72℃之间都会得到好的结果。
③延伸（extension）
一般引物延伸是在72℃下进行。对2Kb长的产品扩增时间多采用1min。
④循环次数（cycle）
一般为30个循环，如果循环次数过多会增加非特异性产物的量。
1、1.取一个0.2mleppendorf管，添加以下各种成分反应液
ddH2O12.1µl
模板DNA0.5µl（20-40ng）原质粒进行(jìnxíng)1：20倍稀释
上游引物(100µmol/L)0.3µl
下游引物(100µmol/L)0.3µl
dNTPmixture(10mmol/L)2µl
10倍×缓冲液2.5µl
Taq酶0.4µl
总体积20µl
2.稍作离心，将反应管放入PCR仪中。3.设定反应(fǎnyìng)程序：
94℃条件下使模板DNA预变性5min。
变性94℃30s
退火55℃45s30cycles
延伸72℃90s
最后在72℃条件进行延伸7min。
4℃保温
4.取8µl反应(fǎnyìng)液用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。